关桦楠-哈尔滨商业大学-基于纳米二氧化硅脂质体反应器的乙酰胆碱酯酶生物传感器的构建研究

基于纳米二氧化硅/脂质体反应器的乙酰胆碱酯酶生物传感
器的构建研究
关桦楠*姜加良陈丹丹王薇王艳辛嘉英
（哈尔滨商业大学食品工程学院哈尔滨150076）
摘要食品中农药的残留不仅对人类健康造成了极大危害，而且还严重制约了我国经济的发展。

研发出适用于常规食品中农药残留的高效快速成套的检测技术，有着重要的社会意义与实际需求。

本文首先利用脂质体技术构建乙酰胆碱酯酶的生物反应器，并采用层层自组装技术制备（纳米二氧化硅/乙酰胆碱酯酶生物反应器）可控多层膜，用以构建新型有机磷农药残留检测电流型生物传感器。

采用扫描电子显微镜获得乙酰胆碱酯酶酶生物反应器与多层酶膜的显微结构，利用电化学分析对新型生物传感器的检测性能进行测量。

实验结果表明，乙酰胆碱酯酶酶生物反应器呈球形且平均粒径为7.3±0.85 µm；生物传感器的多层酶膜的最佳层数为6个双层；以敌敌畏作为有机磷农药模型，在0.25-1.75 μmol/L 和 2.00-10.00 μmol/L的敌敌畏浓度区间内，响应电流与抑制率呈现良好的线性关系，最低检出限达到10 μg/L；所制备生物传感器具有良好的重现性和稳定性。

本研究将为食品中农药残留检测技术的改良提供一种新的思路。

关键词食品安全农药残留生物传感器二氧化硅脂质体
Fabrication of acetylcholinesterase biosensor based on assembly of nano-SiO2 on to liposome
bioreactors
Huanan Guan*Jialiang Jiang Dandan Chen Wei Wang Yan Wang Jiaying Xin
（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076）
Abstract Pesticides residue in food not only had caused the enormous risks to the public health, moreover seriously had also restricted the economy in China.It was essential to develop a rapid and sensitive screening method to ascertain the presence of hazardous compounds for food safety. In this paper, acetylcholinesterase liposomes bioreactor (ALB) were prepared by encapsulating the enzyme AChE in L-α-phosphatidylcholine liposomes resulting in spherical bioreactor with a mean diameter of 7.3± 0.85 µm. A novel amperometric biosensor for organophosphate pesticides based on multilayer films containing SiO2and ALB was developed based on layer-by-layer. Micrographs of SiO2/ALB multilayer films were obtained by scanning electron microscope, and properties of the resulting biosensors were measured by electrochemical measurements. Among the resulting biosensors, the biosensor based on six bilayers of multilayer films was best. Based on the inhibition of organophosphate pesticides on the AChE activity, using dimethoate as a model compound, the inhibition of dimethoate was proportional to its concentration ranging from 0.25 to 1.75 and from 2.00 to 10.00 μM, with a detection limit of 10 μg/L estimated at a signal-to-noise ratio of 3. The developed biosensor exhibited good reproducibility and acceptable stability, thus providing a new promising tool for analysis of pesticide residue.
Key words Food safety Pesticide residue Biosensor SiO2Liposomes
农药残留检测是保障食品安全的基础，是监督管理的重要手段。

为了有效地保障食品安全，就必须对食品中的农药残留进行快速准确的分析监测[1]。

近年来，农药残留检测技术的开发一直是研究的热点，其中利用胆碱酯酶生物传感器检测农药残留的研究十分活跃。

胆碱酯酶通过催化底物水解生成电活性或光活性的物质，当有机磷和氨基甲酸酯类农药残留物加入后会与胆碱酯酶特异性结合，从而使得电活性或光活性物质的产量降低。

因此通过检测光
作者简介：关桦楠，男，1983年生，博士，副教授，食品质量安全研究方向，E-mail: guanhuanan3@ 基金资助：黑龙江省教育厅科研项目(12531152)；国家自然科学基金资助项目(31201376)；
或电信号的衰减即可推算出被检测的农药残留物的量[2-4]。

与此同时，将纳米材料作为固载酶的基底材料已成为当前生物传感器构建研究的热点方向之一[5]。

纳米二氧化硅(SiO2)是一种生物相容性良好的半导体材料，其微结构呈絮状和网状的无定形结构，以SiO2作为固载酶的基底物质可以大大提高酶的有效固载量[6-8]。

脂质体是一种在水相中由磷脂双分子层定向排列而成的直径几纳米至几十微米的超微粒子。

脂质体的内部水相可以包裹几乎任何标记物，脂质体表面也可以通过各种物理或化学方法修饰官能团[9,10]。

为了克服常见胆碱酯酶生物传感器酶活性差和精确度低的缺陷，本文拟采用脂质体技术仿造细胞结构，制备出一种类似于细胞的密闭式的球形生物反应器，并采用穿孔蛋白（Porin）在磷脂层上进行随机打孔，构造出反应物进出“细胞”的孔道，并以乙酰胆碱酯酶为核心元件构建出新型生物反应器，用于提高酶抑制反应时稳定性。

再采用层层自组装技术制备SiO2为基底物质的纳米多层酶膜修饰电极，集成电化学系统成功构建出一种新型的用于检测食品中农药残留的电化学酶生物传感器。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
乙酰胆碱酯酶（AChE）、Porin蛋白、壳聚糖（CS，脱乙酰度85%）、氯化硫代乙酰胆碱(ATChCl)、铁氰酸钾(K3[Fe(CN)6]) 、带负电荷的氢化大豆卵磷脂，胆固醇，荧光黄标记物购自于Sigma-Aldrich公司；碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)购自于Merck China公司；硅酸钠（分析纯）和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自于国药集团化学试剂有限公司；敌敌畏标准品生产于北京恒信生物技术公司（货号：BW7022）。

1.2 乙酰胆碱酯酶生物反应器的制备
精确称取处方量卵磷脂、胆固醇、AChE溶液、荧光黄标记液以及吐温20共溶于10 mL 的二氯甲烷中，所得溶液置于茄形瓶中，于旋转蒸发仪上37°C减压蒸馏，烧瓶转速50-200 rpm。

待烧瓶中二氯甲烷去除干净且在烧瓶壁上形成均匀透明的薄膜后，加入5%的葡萄糖溶液5 mL，继续旋转30 min，使薄膜溶胀水和完全。

悬浮液过滤去杂质，将滤液置于液氮当中1 min，待冷冻完全后迅速放入37°C的水浴锅内，待完全融化后再次放入液氮中冷冻，如此冻融一定数量的循环次数。

冻融结束后，室温驯化10 min，于4°C下保存待用。

1.3 纳米二氧化硅的制备
室温条件下，在搅拌状态进行中(150 rpm)，向20 mL浓度为 1 mol/L的硅酸钠溶液中加入0.1 g CTAB，再加入10 mL（10%，V乙醇/V反应液，V/V）的无水乙醇，然后加入提前配制好的硫酸稀释溶液，充分混合后调节pH值为5，恒温陈化1 h。

以上实验操作在超声波震荡的条件下完成。

将沉淀抽滤，用去离子水清洗至体系中没有酸根离子（滤液不与BaCl2形成白色沉淀时为止），将过滤物干燥，并用马弗炉煅烧，获得纳米二氧化硅颗粒。

1.4 酶纳米传感器的构建
将电极置于壳聚糖溶液中，与恒电位-3.0 V的条件下，静电沉积2 min，在表面形成一层带有正电荷的壳聚糖膜，使用去离子水清洗电极探头表面2遍，去除未沉积的壳聚糖。

然后，将电极再置于纳米氧化硅（SiO2）的水分散液中，静电吸附2 min，再将电极重新放置于壳聚糖溶液中，静电吸附2 min，清洗两次。

放置于5 mg/mL的AChE脂质体生物反应器（ALB）的稀释液中，静电吸附2 min，使用去离子水清洗电极探头表面2遍，去除未被吸附的脂质体生物反应器，此为一个双层，即(ALB/SiO2)1。

通过实验的循环操作，可以根据实验要求实现多层膜的制备。

将吸附有多层膜的滤膜片固定于玻碳电极表面，这种修饰电极
被定义为GCE-(ALB/SiO2)n。

1.5 表征
利用激光散射粒度仪测定AChE脂质体生物反应器和纳米二氧化硅的粒径及分布；利用Zeta电位仪测定AChE脂质体生物反应器和纳米氧化硅的表面电位。

采用扫描电子显微镜对传感器形貌、大小以及整体分布进行测定。

1.6 电化学检测
电极预处理后，将吸附有不同层数酶膜的滤膜片固定于玻碳电极表面置于10 mL的pH 为7.6的磷酸缓冲液（PBS）中，利用循环伏安法对电极进行2次线性伏安扫描，待结果稳定后开始下一步实验。

向反应池中缓慢加入浓度为1 mM的ATChCl底物溶液1 mL，测定不同修饰层数的GCE-(ALB/SiO2)n 电流响应特性，以确定n的合适数值。

将制备好的修饰电极含纳米二氧化硅的电极GCE-(ALB/SiO2)n、未含二氧化硅的电极GCE-(CS/ALB)n和未经修饰的裸电极分别悬置于放有10 mL的PBS(pH7.6)的反应池中，并伴有磁力搅拌。

设置反应环境为pH7.6且环境温度为36°C，向反应池中缓慢加入不同浓度1 mM的ATChCl底物溶液1 mL，待总反应时间15 min后，测定底物与反应器中的酶反应时的电化学行为，比较三种电极的电流响应特性。

用适当pH值的磷酸缓冲液将氯化硫代胆碱配制为1 mM。

以敌敌畏作为农药模型，配置浓度为10-5、10-6、10-8、10-10和10-12 M。

将GCE-(ALB/SiO2)n放置于10 mL的PBS（pH 为7.6）中，分别加入不同浓度的敌敌畏，36°C下抑制35 min，然后迅速加入底物1 mL，混匀，反应15 min。

电化学测定电流相应特征，根据不同浓度敌敌畏引起的电流变化，绘制抑制率曲线，计算抑制率与最低检出限。

2 结果与分析
2.1 AChE脂质体生物反应器(ALB)的表征
制备AChE脂质体，利用适量的Porin蛋白在脂质体的磷脂分子层上进行穿孔，形成亲水通道，构建能够允许特定大小分子（分子量在10000 KD以下的物质）进出并参与反应的AChE生物反应器。

采用激光粒度仪测定AChE生物反应器的粒径大小及粒径分布。

结果表明，AChE生物反应器的粒径分布均匀，有效平均粒径约为7.3± 0.85 µm，其中85%（体系分数）的生物反应器微粒平均粒径为7 µm，多分散系数(PDI)为0.158，数值较小，分散性较好，体系均匀。

图1 AChE生物反应器的扫描电子显微镜图片
Fig. 1 SEM images of AChE bioreactor.
通过扫描电子显微镜了解AChE生物反应器的整体分布、外观形貌和表面结构，结果见图1。

由图1中(A)和(B)可知，以脂质体为基础的生物反应器微粒大小分布均匀，呈现规则的圆球形，球体表面较粗糙但没有明显的缺陷，球体之间彼此紧密排列，且没有聚集融合现象。

部分微粒相互挤压，呈现出一定的压迫形变，展示了较好的外壁韧度和物理强度。

测定制得的5组脂质体的活性包封率的平均值为89.5%，R.S.D%为1.18%，经过计算，1 mg脂质体中的平均酶包覆量约为0.21 mg。

通过Zeta电位仪检测，AChE脂质体生物反应器的表面电势为-78.6 mV，表面呈现较强的负电势，由于采用了表面带负电荷的卵磷脂进行包埋，这将有助于下一步的生物反应器层层自组装实验。

2.2 纳米二氧化硅的表征
本文采用超声-沉淀法制备纳米氧化硅的样品，利用Zeta电位仪测定纳米氧化硅的表面电势，在pH值为4的条件下制备的纳米氧化硅表面电势为-42.5 mV。

激光粒度仪测定纳米氧化硅的平均粒径为115.5±1.86 nm，粒径分布在10 nm-900 nm范围内，其中体系中88%的粒子粒径在100-150 nm之间。

图2所示为纳米氧化硅的扫描电子显微镜图片。

由图2可以看出，纳米氧化硅的粒径分布均匀，没有明显的大块儿团聚现象，且粒径大小为纳米级。

图2纳米氧化硅的扫描电子显微镜图片
Fig. 2 SEM images of nano-silica dioxide sample
2.3基于电流响应特性筛选不同吸附层数的(ALB/SiO2)酶膜
为了考察GCE-(ALB/SiO2)n 的特性，首先需确定酶膜的构成数量，即n的数值，不同的修饰吸附层数对电极的响应具有不同的影响。

本试验中，分别设定n值为1至10，即制备体系1-10个循环。

图3所示为不同吸附层数的酶膜固定于GCE表面参与底物的催化反应时的电流峰值。

由结果可知，从1个双层增加到6个双层，电流的输出峰值逐渐增大，当到达6个双层时，电流输出峰值也达到了最大值16.8 μA。

从7个双层增加至10个双层的的过程中，电流峰值反而逐渐的减小，原因可能是用于催化底物的固载酶达到饱和。

根据试验结果，选择吸附有6个双层的(CS/ALB)的酶膜来修饰玻碳电极，即制备的酶电极为GCE-(ALB/SiO2)6。

图3 不同层数的(ALB/SiO2)对玻碳电极最大输出电流的响应
Fig. 3 Effect of the number of (ALB/SiO2) layers on the magnitude of the output current of the GCE.
2.4 纳米多层酶膜的表征
制备可控多层酶膜，根据前面的研究结果，制备6个双层的酶膜参与下一步实验。

图4所示为(ALB/SiO2)6的扫面电子显微镜照片。

为了便于直观展现(ALB/SiO2)n 中带有负电的AChE生物反应器和纳米氧化硅在带有正电的壳聚糖的作用下逐层吸附的形貌，特将酶膜用金属针进行打孔处理。

由图4 A可以清楚地了解到，从处理后的凹陷处看出，AChE生物反应器与纳米氧化硅是逐层结合的，膜与膜之间区别明显，脂质体生物反应器的球体交叠累加，密度较大且数量较多。

图4B所示为多层膜最上面一层的AChE脂质体生物反应器，这一层也是制备实验的最后一次吸附。

由图可知，AChE生物反应器呈镶嵌状固定于纳米氧化硅膜中，彼此排列紧密均匀。

SEM图片说明了利用本章实验的方法纳米氧化硅可以作为吸附介
质参与酶的固定。

图4 (ALB/SiO2)6多层膜的扫描电子显微镜图片: A: 放大1000倍；B: 放大3000倍.
Fig. 4 SEM micrographs of (ALB/SiO2)6: (A) 1000 times magnification (B) 3000 times magnification.
2.5 GCE-( ALB/SiO2)6的电化学行为研究
利用循环伏安法研究GCE-(ALB/SiO2)6的电化学行为，测定时以50 mV/s的扫描速度在
0.8~-0.2的区间内进行扫描。

裸GCE与GCE-(CS/ALB)5和GCE-(ALB/SiO2)6的循环伏安曲线对比如图5所示。

由图5可知，在底物没有加入到反应体系时，三种类型的工作电极都没有产生明显电化学响应，没有出现氧化还原峰。

在pH为7.6的PBS中，GCE-(ALB/SiO2)6的电流响应稍高于GCE-(CS/ALB)5。

当向反应体系中加入底物溶液时，三种类型的工作电极的特征氧化峰显著增加。

GCE-(ALB/SiO2)6的特征氧化峰的出现，说明了电极表面所固定的酶膜参与了催化底物的反应，并产生了电化学响应。

从图可知，GCE-(ALB/SiO2)6的特征氧化峰（曲线f）的峰电流大于GCE-(CS/ALB)5的峰电流（曲线d），说明了酶膜中的纳米氧化硅提高了整个修饰电极的电化学性能，增强了电子的传导性。

GCE-(ALB/SiO2)6与GCE-(CS/ALB)5的氧化峰出现在0.65~0.7 V之间，两种电极的氧化峰彼此之间没有出现明显的正负方向移动。

上一章中GCE-(CS/ALB)5的氧化峰较裸电极的峰位产生了明显的负移动，推测原因是壳聚糖的电子传输效应导致的。

本研究中两种修饰电极峰位基本一致，可能是壳聚糖的电子传输效应在一定吸附层数的范围内到达饱和，不再产生负移动[11]。

图5 伏安法对比裸GCE、GCE-(CS/ALB)5和GCE-(ALB/SiO2)6电化学行为.
a：GCE-(CS/ALB)5；b：裸GCE；c：GCE-(ALB/SiO2)6；d：GCE-(CS/ALB)5在含有1 mM底物的PBS中；e：裸GCE在含有1 mM底物的PBS中；f：GCE-(ALB/SiO2)6 在含有1 mM底物的PBS中，扫描速率50 mV/s. Fig. 5 (A) Cyclic voltammograms of GCE-(CS/ALB)5 (a), bare GCE (b), GCE-(ALB/SiO2)6 (c), GCE-(CS/ALB)5
(d), bare GCE (e) and GCE-(ALB/SiO2)6 (f) in pH 7.6 PBS containing 1 mM A TChCl, scan rate 50 mV/s.
2.6 GCE-( ALB/SiO2)6对农药的响应
当底物浓度一定时，电流响应的改变仅与酶的活性有关，农药的加入会抑制酶的活性，因此可以通过电化学测试来检测农药的含量。

分别向反应体系中加入事先配置好的敌敌畏标准液，抑制合适时间后，加入底物，反应彻底后利用循环伏安法来测定修饰电极对农药敌敌畏的响应。

如图6所示，峰电流值下降由于乙酰胆碱酯酶的催化活性被抑制导致电流下降，且电流下降的程度与溶液中的抑制剂敌敌畏的浓度成正比。

图6不同农药浓度对GCE-(ALB/SiO2)6的响应
Fig. 6 Effect of different concentrations of pesticide on GCE-(ALB/SiO2)6.
敌敌畏浓度增加与峰电流减小存在一定的线性关系，利用此关系，得出酶抑制率的计算公式为[4]：
抑制率I%=(I0-I1)/I0×l00%
式中：I为抑制率( %)；I0和I1分别是抑制前后的峰电流值。

根据抑制率和农药浓度构建GCE-(ALB/SiO2)6检测敌敌畏的抑制率曲线，如图7。

由图7可知，农药抑制率与农药的浓度在一定范围内存在线性关系。

在0.25-1.75 μM的范围内抑制率回归方程为I% = (28.58c+5.35)%，相关系数R2为0.9987。

在2-10 μM的范围内抑制率回归方程为I% = (2.38c+51.25)%，相关系数R2为0.9995。

检出限为0.73±0.098 μg /L，远远低于国家要求的水样中10 μg/L的敌敌畏最大残留量。

说明利用GCE-(ALB/SiO2)6检测敌敌畏时具有较高的灵敏度。

实验结果表明，回收率在85%-105%之间，且R.S.D%数值较小，在5%-8%之间，说明建立的检测方法符合检测准确度和重复性的要求。

图7 敌敌畏抑制率曲线. A: 0.25-1.75 μM的范围内抑制率校正曲线; B: 2-10 μM的范围内抑制率校正曲线. Fig. 7 Inhibition curves for dichlorvos. A: the calibration curves for dichlorvos determination at 0.25-1.75 μM; B: the calibration curves for dichlorvos determination at 2-10 μM.
3 结论
本文旨在建立快速检测果蔬中有机磷和氨基甲酸酯农药残留的电化学酶生物传感器。

研究中以玻碳电极作为信号转换器，乙酰胆碱酯酶的生物反应器作为核心元件，纳米氧化锌作
为载酶基质和电极修饰材料，构建出新型的酶纳米生物传感器，并对其农药残留的检测性能进行评估。

研究结果表明，所制备的以GCE-(ALB/SiO2)6为核心的新型传感器检测农药敌敌畏时具有较高的灵敏度、准确度和重复性。

本研究将为食品中农药残留检测方法的改进，积累基础资料。

4 参考文献
[1] M. Kappor, R. Rajagopal. Enzymatic bioremediation of organophosphorus insecticides by recombinant
organophosphorous hydrolase [J]. Int. Biodeterior. Biodegrad. 2011, 65: 896-901.
[2] G. Istamboulie, S. Andreescu, J.L. Marty,et al. Highly sensitive detection of organophosphorus insecticides
using magneticmicrobeads and genetically engineered acetylcholinesterase [J]. Biosens Bioelectron. 2007, 23: 506-512.
[3] V. Vamvakaki, N.A. Chaniotakis. Pesticide detection with a liposome-based nano-biosensor [J]. Biosens
Bioelectron. 2007, 22: 2848-2853.
[4] T. Liu, H.C. Su, X.J. Qu, et al. Acetylcholinesterase biosensor based on 3-carboxyphenylboronic acid/reduced
graphene oxide–gold nanocomposites modified electrode for amperometric detection of organophosphorus and carbamate pesticides [J]. Sens Actuator B. 2011, 160: 1255-1261.
[5] G.B. Yang, H.X. Ma, L.G. Yu. Preparation and characterization of layer-by-layer self-assembled polyelectrolyte
multilayer films doped with surface-capped SiO2 nanoparticles [J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2009, 333, 776-781.
[6] 林金辉, 王美平, 魏双凤. 超细SiO2的化学沉淀法制备及其原位改性[J]. 硅酸盐学报, 2007, 26(4):
841-844.
[7] J.G. Checmanowski, J. Gluszek, J. Masalski. Role of nanosilica and surfactants in preparation of SiO2 coatings
by sol-gel process [J]. Ochrona Przed Korozja, 2002, 11: 214-218.
[8] H.H.P Yiu, P.A. Wright, N.P. Botting. Enzyme immobilization using siliceous mesoporous molecular [J].
Micropor Mesopor Mater, 2001, 44/45: 763-769.
[9] A.M. Smith, M.R. Jaime-Fonseca, L.M. Grover, et al. Alginate-loaded liposomes can protect encapsulated
alkaline phosphatase functionality when exposed to gastric pH [J]. J. Agric. Food Chem. 2010, 58: 4719-4724.
[10] J.A. Ho, H.W. Hsu, M.R. Huang. Liposome-based microcapillary immunosensor for detection of Escherichia
coli O157: H7 [J]. Anal Biochem. 2004, 330: 342-349.
[11] Q. Chen, J. Han, H. Shi, et al. Use of chitosan for developing layer-by-layer multilayer thin films containing
glucose oxidase for biosensor applications [J]. Sensor Lett, 2004, 1: 102-105.。