高效液相色谱_等离子体质谱联用方法研究富硒大米中硒的形态

高效液相色谱2等离子体质谱联用方法

研究富硒大米中硒的形态

张涛

1,2　高愈希

31　李柏1　李玉锋1　陈春英1　吴刚21(中国科学院高能物理研究所核分析技术重点实验室,纳米生物效应与安全性实验室,北京100049)2(包头医学院基础医学部,包头014010)

摘　要　根据O sborne 溶解性蛋白质分类法,用去离子水、2%NaCl 溶液、70%乙醇、015%K OH 4种溶液分别提取出大米中相应的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白。利用电感耦合等离子质谱(I CP 2MS )测量各类蛋白提取液中的硒含量;用色谱与质谱联用法对大米蛋白提取液中含硒蛋白组分及含硒氨基酸组成进行初步分析。结果表明:大米中的硒主要与蛋白质结合,在4类蛋白提取液中硒含量由高到低的分布顺序为:谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白。清蛋白提取液中,分子量为1216k Da 蛋白是主要的含硒蛋白组分;大米中约30%的硒以硒代半胱氨酸形式存在。

关键词　大米,硒,形态分析,高效液相色谱,电感耦合等离子质谱

　2007205205收稿;2007208206接受

本文系国家自然科学基金(Nos .10475092、10490180、20777075)和中国科学院方向性项目(No .KJCX3.SY W.N3)资助

3E 2mail:gaoyx@mail .ihep.ac .cn

1　引　言

硒是一种人体必需的微量元素,在体内充当多种含硒酶如谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心,发挥着抗氧化,保护细胞膜免受氧自由基氧化损伤的作用。此外还具有提高机体免疫力以及消除重金属积累和毒性等生理生化功能。人体缺硒可以导致克山氏病、大骨节病等一系列疾病。补硒可以预防相关疾病的发生。目前市场上出现了许多富硒食品和保健品,如富硒米、富硒香菇、富硒螺旋藻、富硒酵母等。研究它们的硒含量及形态对其品质评价具有重要的意义。

大米是人类的传统主食,其硒含量、形态与人体硒营养状况密切相关。大米中硒形态主要分为无机硒和有机硒两大类。无机硒包括硒酸(selenate )、亚硒酸(selenite );有机硒则包括硒代半胱氨酸(selenocys 2tine )、硒代蛋氨酸(selenomethi onine )等含硒小分子以及硒与碳、硫等原子相结合而形成的含硒生物大分

子。王军等[1]采用电感耦合等离子体质谱(I CP 2MS )方法测定了鱼中痕量硒。杨容甫等[2]用二氨基萘荧

光分析法测定了用叶面喷硒法培养出的富硒米中的总硒、有机硒及硒代蛋氨酸的含量。证实该富硒米中绝大部分为有机硒,约占总硒含量的99%以上,主要以硒代蛋氨酸形式存在。本实验为了分析富硒米中的硒含量及形态,采取顺序搅拌离心法提取4类蛋白质,利用I CP 2MS 测量其中的硒含量;使用体积排阻色谱和电感耦合等离子质谱联用方法(SEC 2UV 2I CP 2MS )初步分析大米蛋白提取液中含硒蛋白的分布;用反相离子对色谱结合电感耦合等离子质谱(RP LC 2I CP 2MS )分析与大米蛋白结合的含硒氨基酸的种类。2　实验部分

211　仪器与试剂

Ther mo X7电感耦合等离子质谱仪(美国Ther mo 公司);高效液相色谱仪(W aters 公司);富硒大米(安徽天长良圆米业有限公司);胰蛋白酶(德国Serva 公司);蛋白酶K 、链霉蛋白酶(德国Merck 公司);乙醇、HNO 3、H 2O 2、H 3P O 4均为国产优级纯试剂;其余为国产分析纯试剂。样品处理及溶液配制全部使用经M illi Q 纯净水机处理的去离子水。

212　大米蛋白质的提取和浓缩

将大米粉碎、研磨,过01089mm 孔径筛,贮存于干燥器中备用。用去离子水、2%NaCl 溶液、70%乙醇、015%K OH 溶液顺序提取相应蛋白,提取过程见图1。

第36卷2008年2月 分析化学(FE NX I HUAX UE )　研究报告Chinese Journal of Analytical Che m istry

第2期206～210

在更换不同溶剂时,加入去离子水20mL 搅拌10m in,以3000r/m in 离心10m in,吸去上层清液以去　图1　大米中4种蛋白提取分离流程

Fig .1　Sche me f or extracti on and separati on of f our ty pes of p r otein fr o m rice

除残留的溶剂。同一种溶剂共提取5次。前3次溶剂

体积为20mL,搅拌20m in;后两次中每次加入溶剂体

积减少为15mL,搅拌时间延长到30m in 。每步得到的

提取液用考马斯亮兰G 2250染色法[2]测定其中的蛋白

含量。提取完毕后将同种蛋白提取液合并,其中清蛋

白、球蛋白、谷蛋白提取液进行冷冻干燥,所得的清蛋

白、球蛋白、谷蛋白提取液冻干粉分别称重,干燥保存;

醇溶蛋白提取液在室温通风条件下挥发溶剂,记录浓

缩后醇溶蛋白体积。

213　蛋白提取液中硒含量的测定

取一定量的蛋白提取液冻干粉、浓缩液及米粉,加

入6倍体积的V (HNO 3)∶V (30%H 2O 2)=4∶1混合溶

液,170℃下密闭消化8h,而后控制温度在80℃,蒸

发消化液至011～012mL,用2%HNO 3定容至2mL,

同时以去离子水做试剂空白,以标准参考物质米粉

(N I CE No .10)作为对照以检验分析结果的可靠性。使用I CP 2MS 测量硒同位素80Se,为消除聚合离

子40A r +2对80

Se 的干扰,本研究采用碰撞反应池技术(CCT )测定模式,碰撞气为氢氦混合气(含7128%H 2),流速为715mL /m in;辅助氩气流速018L /m in 。214　清蛋白提取液中的含硒蛋白分析

把干燥后的清蛋白提取液用体积排阻色谱流动相完全溶解,利用体积排阻色谱法分离蛋白。色谱柱为Pr otein 2Pak 300S W 排阻色谱柱(300mm ×8mm ),流动相为50mmol/L Tris 2HCl (pH 714),流速为015mL /m in,50μL 。用紫外检测器在波长280n m 处检测蛋白信号,用I CP 2MS 同步检测洗脱液中的硒含量。

215　大米蛋白结合含硒氨基酸分析

称取1g 米粉溶解在6mL Tric 2HCl (30mmol/L pH 712)中,超声5m in;每隔12h 依次加入胰蛋白酶(15mg )、蛋白酶K (10mg )及链霉蛋白酶(15mg ),在37℃下振荡酶解(摇速为100～120r/m in )共计36h 。

酶解后,以4000r/m in 离心10m in;上清液用截留分子量为3kDa 的超滤管离心除去蛋白酶及大分子物质,用RP LC 2I CP 2MS 分析酶解液中的硒代氨基酸含量。反相色谱柱为W aters 5μm Sy mmetry Shield RP18反相柱(150mm ×319mm )并联有5μm Sy mmetry Shield RP18保护柱(20mm ×319mm );流动相为011%七氟丁酸,含甲醇013%和2%(V /V ),流速018mL /m in;进样量为50μL 。由于反相离子对色谱的流动相可直接应用于I CP 2MS 检测器,色谱与质谱系统采用PEEK 管直接连接,以色谱手动进样器为质谱工作的触发信号,采用峰面积定量。3　结果与讨论

311　4种大米蛋白组分的提取

大米蛋白主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4种蛋白组成,蛋白含量约占大米总重的

7%[3]。本研究根据O sbr one 对谷物蛋白质组分分类原则[4],尝试用顺序搅拌离心法分离提取以上4类蛋白。根据每步提取液的蛋白浓度及体积,计算出提取蛋白的质量,结果见表1。

从表1可见,随着提取次数的增加,同一类蛋白提取液中蛋白含量一般逐渐减少,但醇溶蛋白和谷蛋白第5次提取质量却出现升高。5g 大米中提取蛋白总计15915mg,按蛋白含量占大米总量的7%计,回收率约为46%。这一结果说明所采取的提取条件,还未能将所有蛋白提取出来。增加提取次数,延长提取时间是提高蛋白质提取回收率的有效办法。从提取得到的4类蛋白的质量来看,谷蛋白是大米

702第2期张涛等:高效液相色谱2等离子体质谱联用方法研究富硒大米中硒的形态