体外受精失败的原因及对策

体外受精失败的原因及对策
刘平，郑晓英
作者单位:北京大学第三医院生殖医学中心，北京100191
摘要:在接受体外受精胚胎移植治疗的患者中，有时会出现全部获取的卵母细胞均未受精现象，即受精失败。

其原因可能为精子与透明带结合失败和(或)精子穿透异常、卵母细胞激活失败等。

目前尚缺乏准确的预测受精失败的方法，临床上一旦出现受精失败应采取积极的补救措施，并根据患者病史、临床特征、配子情况对患者以后的治疗措施提出建议。

早补救ICSI的有效性和安全性尚需进一步的临床验证。

关键词:受精;完全受精失败;补救卵母细胞浆内单精子注射;卵母细胞激活
Abstract:Total fertilization failures(TFF)are rareevents of in vitro fertilization(IVF).Most cases oc-cur due to lack or dysfunction of sperm binding to/penetrate the zona pellucida or failure of oocyte acti-vation.Fertilization failure is not predictable becauseof lacking accurately and sensitive method.The clin-ical value of rescue ICSI should be fully considerableaccording to patient history，clinical character andgametes quality.Long term evaluation of babies re-sulting from the application of early rescue ICSI isneeded to confirm empirically the safety of this meth-od.
Keywords:fertilization;total fertilization failure;res-cue ICSI;oocyte activation
完全受精失败(total fertilization failures，TFF)指在体外受精—包括常规体外受精(in vitro fertilization，IVF)和卵母细胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injecting，ICSI)的显微受精后的一定时段内，精卵没能结合为合子，形态学上没有看到精原核和卵原核形成的现象。

多年来的ICSI应用证实:虽然ICSI技术绕开了精子穿越透明带、精卵质膜融合等过程，将精子直接注入卵母细胞内，仍有20%～30%的卵母细胞不能正常受精。

在IVF助孕治疗中，个别患者会出现全部卵母细胞不受精的受精失败，这种现象在常规IVF周期的发生率约为5%～10%[1]，ICSI周期的发生率为1%～3%[2]。

受精失败不仅与精子和卵的质量、受精过程体外环境等因素有关，也可能是某些不明原因性不孕症夫妇长期不能自然受孕的病因所在。

当一次取卵获得的多个卵母细胞中有少部分未受精时，被认为是可接受的，但当全部卵母细胞受精失败时，整个治疗过程不得不中断，不仅使医生和胚胎学家感到沮丧，对接受助孕治疗的夫妇更是巨大的精神打击。

如何预防和避免受精失败成为改善某些患者IVF结局的重要环节。

1受精失败原因分析
受精失败的原因大致可分为下列3种情况。

1.1精子穿透失败对IVF常规受精周期的未受精卵进行免疫荧光染色分析，发现56%～92%的未受精卵母细胞中可见到清晰的卵母细胞的染色体，但是找不到精子的染色质，提示精子透明带(zona pellucida，ZP)结合和穿透异常是IVF受精失败的常见原因[1]。

精子与ZP的作用相当复杂，通过精子表面的卵结合蛋白与ZP上的精子受体相互识别。

如果先天或后天的卵结合蛋白、ZP糖蛋白异常都会影响精卵正常结合，致使受精失败。

Mannikko等[3]报道人ZP基因序列存在着多个单核苷酸多态(SNP)，其中ZP3SNP位点不同的基因型与IVF 受精失败相关。

常规精液分析无法检测精子透明带结合或顶体反应的异常，必须通过特殊检查如精子透明带结合/穿透实验才能发现。

但这类实验操作繁琐，材料来源困难，因此尚难以在临床上大规模应用。

1.2卵母细胞激活失败当精子进入卵母细胞后，卵胞质中的精核去凝集因子清除精子染色质中精蛋白二硫键，使精蛋白被组蛋白替代，染色质去致密，与此同时精子头部肿胀，释放卵母细胞活化因子，诱导钙震荡并刺激IP3的产生，激活卵母细胞，诱发一系列复杂的生理过程包括释放皮质颗粒、恢复减数分裂、排出第二极体等，完成第二次减数分裂。

卵母细胞激活失败是ICSI后受精失败的常见原因，通过荧光染色在卵母细胞内可以见到不同去凝集状态的精子染色质，证实精子已经进入卵母细胞，但由于各种原因不能诱发钙震荡或震荡频率异常等不能激活卵母细胞，包括:(1)卵母细胞胞质不成熟致活化异常;虽然卵母细胞已经排出第一极体达到了核成熟，但是胞核和胞质成熟不同步，不能完成第二次减数分裂。

胞质内含有的凝集因子(如MPF)使精子出现早熟染色体凝集(premature chromosomalcondensation，PCC)，不能转变为雄性原核;(2)精子异常:近年来的实验证实:精子的赤道板区含有一种特殊的磷脂酶———PLC zeta，将其直接注入卵母细胞可以诱发与受精过程相类似的钙震荡[4];缺乏PLC zeta的精子则不能诱发钙震荡，从而导致受精失败[5]。

但PLC zeta是不是引起钙震荡的唯一物质还待证实。

1.3原核形成和(或)迁移缺陷核膜重建是原核形成的关键事件，受到卵胞质中多种磷酸酶和蛋白激酶的共同调节。

卵母细胞胞质不成熟将影响原核的形成[6]。

雌雄原核形成后雌原核沿精子星状体微管向雄原核移动，直到两者相遇然后共同向卵母细胞中央迁移。

围绕雄性中心粒聚集的微管功能缺失时，可能出现原核迁移缺陷。

2受精失败的挽救
在常规IVF受精完全失败之后，是否应该行补救ICSI(rescue ICSI)使精卵有另一次机会结合完成受精，一直颇有争议。

补救ICSI确实可使部分卵母细胞获得受精并形成胚胎，得到胚胎移植的机会，而且有获得健康后代的可能[7]，但补救ICSI后的着床率和妊娠率均明显降低[8]。

我院总结了75个补救ICSI周期，虽然70周期获得了可移植的胚胎，新鲜胚胎移植后仅有4例(5.71%)获活婴分娩[9]。

一些文献报道的补救ICSI周期中甚至无一例妊娠。

补救ICSI的妊娠率较低的原因有:(1)补救ICSI时机多在IVF受精后15～24h，卵母细胞老化错过了最佳受精时机，影响胚胎的发育潜力;(2)受精后15～24h相当于取卵后18～28h行补救ICSI受精，致使胚胎的发育与子宫内膜的发育不同步，取卵后D3移植的往往是2～4细胞期胚胎。

我们近期的临床资料显示将补救ICSI胚胎冻存，复苏周期根据胚龄计算移植时机，可以获得优于新鲜周期移植的临床妊娠率。

我们认为补救ICSI的治疗方案是否有临床应用价值应结合患者病史、卵母细胞数量和成熟度、精子情况综合分析。

如果是由于取卵日卵母细胞成熟不佳引起的受精失败，经过一天的培养后卵母细胞成熟，在此基础上尽
早行补救ICSI，极有可能获得妊娠和分娩;或者由于精子功能异常引起受精失败，补救性的ICSI能够帮助跨越精卵结合屏障，也是有意义的;对卵母细胞较少、精子和(或)卵母细胞无明显异常的常规受精失败周期来说，补救ICSI的作用有限。

由于卵母细胞老化是影响补救ICSI临床结局的关键因素，Chen等[11]
提出应该在常规IVF后尽早判断卵母细胞受精与否，在卵母细胞老化前及时进行补救ICSI。

在精卵混合培养后6h，机械剥除卵丘和放射冠等卵周围的结构，观察以第二极体排出作为标志的受精早期迹象，如果所有卵母细胞均未出现第二极体则拟判为全部受精失败，立即行补救ICSI，获得了48.5%的临床妊娠率，明显优于受精后22h行补救ICSI组。

随后国内同仁的工作也提示早补救ICSI可以得到较满意的临床结局[12]。

但是，早补救ICSI
方法也同样引起了人们的担忧和质疑。

常规受精后6h是卵母细胞激活、原核形成的关键时期，此时进行观察是否会干扰胚胎的正常发育过程?如何鉴别第二极体与碎裂的第一极体?早补救ICSI会不会导致多精受精率的增加?理论上所有受精卵均应在受精8h内排出第二极体，在受精后6h观察，可能会有10%左右的卵母细胞由于第二极体排出延迟而被误认为未受精。

因此Chen等[11]提出将观察时间由受精后6h改为8h将大大降低判断错误的风险。

为了避免碎裂极体对受精观察的混淆，有研究仍以观察原核的方法来推测受精，观察发现在与精子接触4～6h之间即可有个别卵开始出现原核，精卵混合培养8h，受精正常的病例至少会有一个卵出现原核[13]。

否则，应警惕受精失败或受精率低的可能，结合第二极体出现情况，采取早期补救ICSI。

但是8h可能错过最佳受精窗口期，虽然可以获得较好的受精率，妊娠率却显著降低[14]。

尽管早补救ICSI的临床结局优于传统的补救ICSI，但早补救ICSI 与IVF正常受精周期的临床结局是否接近报道不一致。

Nagy等[15]在早补救ICSI周期中继续发育到妊娠中期的胚胎仅为移植胚胎数目的8%，认为早补救ICSI技术的临床结局差。

早补救ICSI临床应用价值和安全性有待进一步验证，目前已出生婴儿的情况与常规IVF周期比较没有差别[16]。

3对既往受精失败史患者的治疗对于既往IVF助孕治疗时曾发生过常规受精失败的病例，文献报道再次发生受精失败的风险可达30%～50%[17]，应结合患者年龄、不孕症病史、控制性超排卵方案、卵母细胞形态、数量与成熟度、以及精子功能检测综合分析受精失败原因。

如果是精子穿透异常未能进入卵母细胞所引起，下一周期采取ICSI受精方式可以有效提高受精率和临床妊娠率。

卵母细胞质量或成熟欠佳引起的受精失败，采用ICSI并不能改善临床结局，临床卵巢刺激方案的调整可能起到一些作用。

在无法区别卵母细胞因素或精子因素导致的受精失败的情况下，可与患者充分沟通，建议选择部分卵母细胞ICSI减少再次受精失败风险[17]。

有文献认为因既往有受精失败史而行ICSI患者的临床结局显著低于因男性因素不孕而行ICSI者，提示这类患者可能存在卵母细胞的某些功能缺陷，ICSI不能改变其受精失败的命运[18];但也有不同观点，Kinzer等[19]总结了281例既往受精失败史患者继续治疗后的临床结局，每移植周期的妊娠率达到25%，与同期因男性因素不孕第二次行ICSI治疗的临床结局(24%)相同，说明不同刺激周期卵母细胞质量的变化是改善患者预后的关键因素。

ICSI后受精失败的真正原因目前尚不清楚。

事实上，对成熟的卵母细胞ICSI后仍有大约有30%不能受精[20]。

因为ICSI仅能在帮助精子进入卵母细胞这个环节上起作用，而精子必须在穿透卵母细胞后完成卵子激活，第二极体排出，精子DNA去紧密化和精卵原核形成等一系列的细胞和分子水平的变化，才能完成受精过程，ICSI后的受精过程是在卵母细胞主导下完成的。

对于曾经在某次IVF治疗中发生TFF患者，如果能获得一定数量、形态正常的卵母细胞和精子，可以建议患者再次治疗时直接采用ICSI，85%的患者出现正常受精，1/3的患者可以获得妊娠[21-22]。

如反复ICSI受精失败，可能与卵母细胞未激活有关，可试用各种辅助方法激活卵母细胞，包括ICSI后用钙离子载体，用含高浓度钙离子的培养基、用电刺激辅助激活卵母细胞等，可提高受精率，目前已有个别成功分娩的病例报道[23-24]。

但是该技术在有效性和对子代安全性方面尚不明确，应慎重应用。

在目前尚无准确预测受精失败的手段的情况下，应加强对受精过程的基础和临床研究，在实际工作中，一旦出现受精失败，应采取积极措施应对，包括尽早利用补救ICSI对本次治疗结局的挽救，以及通过对患者的病史、临床特征、配子质量和数量综合评价，对该患者今后的治疗提出积极建议。

事实证明，有过受精失败史的夫妇再次助孕治疗依然有机会得到自己的后代。

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