色谱毛细管电泳法
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• 被多国药典收载，如2010年版中国药典对盐酸头 孢吡肟中N-甲基吡咯烷的检查，USP对盐酸罗哌 卡因的对映体纯度检查，均采用毛细管电泳法测 定
一、基本原理
• 高效毛细管电泳以高压电场为驱动力，以毛 细管为分离通道，依据各组分之间的迁移速 度和分配行为上的差异而实现分离的一类技 术
• 在毛细管电泳中有两个重要的迁移： –电泳迁移 –电渗流迁移
• 进样塞长度——在进样过程中减少样品塞长度 非常重要。对进样长度的限制是低于毛细管总 长度的（1～2）%。例 70cm长的毛细管，进样 量应小于7mm
•影响分离效率的因素
• 溶质与管壁相互作用——可能导致峰拖尾或发 生对溶质的完全吸附。对多肽和蛋白质来说， 这种吸附特别严重。可采用多种方法来减少相 互作用： –增加缓冲液浓度以降低有效表面电荷 –在极端pH值下进行分离，使石英表面硅羟基 以不带电的形式存在 –对毛细管壁进行涂层处理
•电渗流作用示意图
电渗流
在电场 作用下
•电渗流性质
• 电渗流的一个独特性质是其具有平面流 型，推动液体流动的力在毛细管内均匀 分布，平面流型的优点是对谱带的扩散 没有直接作用
•带电微粒在毛细管内的移动的速度
• 带电微粒在毛细管内的移动的速度为电泳流
和电渗流的矢量和。 = (e + eof）V/L
• 一般情况下，电渗流的方向是由正极向负极 移动，而电渗流的速度又远大于电泳流
故所有组分均向同一方向——阴极移动 ，但速度各不相同
•淌度与迁移时间
Ll
Tm= e V
• 式中L为毛细管总长度， l为毛细管有效 长度（进样点到检测器距离），V为电 压
• 当L， l， V一定时， Tm与e成反比
•电渗流后的迁移时间
•电泳迁移
• 在电场作用下，带电组分作定向移动。
其迁移速度（）可用下式表示：
= eE
（1）
–e为电泳淌度
–E为电场强度（V/L）——是外加电
压和毛细管长度的函数
•电泳迁移原理
• 对于给定的离子和介质，淌度e为离子的特 征常数，其大小取决于分子所受的电场力FE 和其通过介质时的摩擦力FF的平衡：
• 分离度R = Z / 4
（Z为两峰间距，为峰标准差）
• 理想条件下理论板数n与电压V的关系可表示为：
• N=（ e＋ eof）·V·l / 2DL（式中D为扩散系数 ）
• D值小的大分子扩散小，柱效高
• 在高电场下(V值大)，溶质在毛细管内停留时间短
，扩散小， 柱效高 W=4
R=
2（tR2-tR1）
FE = qE
（q为离子电量）
FF= －6r
（ 溶液粘度, r 离子半径, 离子速度）
• 达到平衡时，两种力大小相等而方向相反， 即
qE =6r
（2）
•电泳迁移原理
• 根据式(1) =eE ，淌度e=/E • 根据式(2) qE=6r，/E =q/(6r)
• 所以 e= q/(6r )
（3）
• 式（3）表明，带电量大的物质，离子半
溶质电导低于缓冲 液，产生拖尾峰
三、分离模式
• 毛细管电泳的操作方式有多种，分离机制各 不相同，常用的分离模式有：
方式
分离依据
毛细管区带电泳（CZE） 自由溶液的淌度
胶束电动色谱（MECC） 疏水性/离子性相互作用
毛细管凝胶色谱（CGE） 分子大小/ 电荷
毛细管等电聚焦（CIEF） 等电点
毛细管等速电泳（CITP） 移动界面
W1+W2
在实际工作中，按 HPLC方法求得理论板数 ： N=5.54（t/w1/2）2
•影响分离效率的因素
• 焦耳热与温度梯度——电流通过而产生的热称 为焦耳热。受毛细管尺寸、溶液电导、外加电 压等影响
• 不均匀的温度梯度和局部的黏度变化会引起区 带展宽。温度变化1℃→黏度变化2%～3% →淌 度变化2%～3%
径小的物质有较高的淌度
•淌度
• 淌度——物理常数，是在溶质带最大电 量时测定并外推至无限稀释条件下的数 值，即绝对淌度
• 有效淌度——实验条件下测得的数值， 其取决于操作缓冲液的pH值和组成
•溶液pH值对淌度的影响
• 若两种溶质在完全离 子化状态下，具有相 同的电泳淌度，则因 没有差速迁移而不能 分离
• Tm=L·l/（ e + eof ）·V • （e + eof ）称为表观淌度a（即在电渗
流存在下测得的淌度）
• 溶质从进样点迁移至检测点所用的时间称 为“迁移时间(t)”，根据上式可计算溶质的 表观淌度：
• a =e＋ eof = L·l/t·V • 当L、l、V一定时， a与 t 成反比
二、分离度与理论板数
毛细管电色谱（CEC） 样品与固定相间相互作用
毛细管区带电泳（CZE）
• CZE是应用最广泛的一种技术，在毛细管内 充满缓冲液，不同质荷比大小的组分在电 场的作用下，根据迁移速度不同而达到分 离
• 缓冲液选择 –因电渗流（EOF）对pH值很敏感，故要求 采用缓冲液来维持恒定的pH值
•对缓冲液的要求
• 但若它们具有不同的 pKa值，则可调节溶 液pH值，使他们具有 不同的有效淌度，而 达到分离的目的
•电渗流（EOF）
• 毛细管电泳中的一个重要现象，是毛细管内壁表 面电荷所引起的管内液体整体流动的现象，是推 动来自百度文库体前进的驱动力
• 当固体与液体接触时，固-液两相界面上会带有相 反符号的电荷，形成双电层。对于石英毛细管柱 ，当溶液pH值达4以上时，其内壁带负电荷，管中 液体将感应一层正电荷，形成双电层，在高电压 作用下缓冲液整体向负极移动，此即电渗流 (eof)
• 电分散作用——样品区带与操作缓冲液的电导 差异可产生峰型畸变
•样品与缓冲液电导不匹配引起的电分散
高电导
等电导
＋
－＋
buffer
◎ ◎ ◎
◎ ◎◎ ◎
buffer
buffer
◎◎◎◎◎◎
－
buffer
样品区带
样品区带
低电导
＋
－
◎
buffer
◎ ◎
◎ ◎ ◎
buffer
样品区带
溶质电导高于缓冲 液，产生前沿峰
–强缓冲能力，低的紫外吸收，小的淌度。 –常用的缓冲液有Tris（三羟甲基氨基丙烷
色谱毛细管电泳法
2020年5月17日星期日
概述
• 毛细管电泳又叫高效毛细管电泳 (HPCE)，是80 年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是 电泳技术与层析技术相结合的产物
• 广泛用于生物大分子，手性药物，生物体内的药 物及代谢物，中西药物及其制剂等的分析，在选 择性上与高效液相法有很大的互补性
一、基本原理
• 高效毛细管电泳以高压电场为驱动力，以毛 细管为分离通道，依据各组分之间的迁移速 度和分配行为上的差异而实现分离的一类技 术
• 在毛细管电泳中有两个重要的迁移： –电泳迁移 –电渗流迁移
• 进样塞长度——在进样过程中减少样品塞长度 非常重要。对进样长度的限制是低于毛细管总 长度的（1～2）%。例 70cm长的毛细管，进样 量应小于7mm
•影响分离效率的因素
• 溶质与管壁相互作用——可能导致峰拖尾或发 生对溶质的完全吸附。对多肽和蛋白质来说， 这种吸附特别严重。可采用多种方法来减少相 互作用： –增加缓冲液浓度以降低有效表面电荷 –在极端pH值下进行分离，使石英表面硅羟基 以不带电的形式存在 –对毛细管壁进行涂层处理
•电渗流作用示意图
电渗流
在电场 作用下
•电渗流性质
• 电渗流的一个独特性质是其具有平面流 型，推动液体流动的力在毛细管内均匀 分布，平面流型的优点是对谱带的扩散 没有直接作用
•带电微粒在毛细管内的移动的速度
• 带电微粒在毛细管内的移动的速度为电泳流
和电渗流的矢量和。 = (e + eof）V/L
• 一般情况下，电渗流的方向是由正极向负极 移动，而电渗流的速度又远大于电泳流
故所有组分均向同一方向——阴极移动 ，但速度各不相同
•淌度与迁移时间
Ll
Tm= e V
• 式中L为毛细管总长度， l为毛细管有效 长度（进样点到检测器距离），V为电 压
• 当L， l， V一定时， Tm与e成反比
•电渗流后的迁移时间
•电泳迁移
• 在电场作用下，带电组分作定向移动。
其迁移速度（）可用下式表示：
= eE
（1）
–e为电泳淌度
–E为电场强度（V/L）——是外加电
压和毛细管长度的函数
•电泳迁移原理
• 对于给定的离子和介质，淌度e为离子的特 征常数，其大小取决于分子所受的电场力FE 和其通过介质时的摩擦力FF的平衡：
• 分离度R = Z / 4
（Z为两峰间距，为峰标准差）
• 理想条件下理论板数n与电压V的关系可表示为：
• N=（ e＋ eof）·V·l / 2DL（式中D为扩散系数 ）
• D值小的大分子扩散小，柱效高
• 在高电场下(V值大)，溶质在毛细管内停留时间短
，扩散小， 柱效高 W=4
R=
2（tR2-tR1）
FE = qE
（q为离子电量）
FF= －6r
（ 溶液粘度, r 离子半径, 离子速度）
• 达到平衡时，两种力大小相等而方向相反， 即
qE =6r
（2）
•电泳迁移原理
• 根据式(1) =eE ，淌度e=/E • 根据式(2) qE=6r，/E =q/(6r)
• 所以 e= q/(6r )
（3）
• 式（3）表明，带电量大的物质，离子半
溶质电导低于缓冲 液，产生拖尾峰
三、分离模式
• 毛细管电泳的操作方式有多种，分离机制各 不相同，常用的分离模式有：
方式
分离依据
毛细管区带电泳（CZE） 自由溶液的淌度
胶束电动色谱（MECC） 疏水性/离子性相互作用
毛细管凝胶色谱（CGE） 分子大小/ 电荷
毛细管等电聚焦（CIEF） 等电点
毛细管等速电泳（CITP） 移动界面
W1+W2
在实际工作中，按 HPLC方法求得理论板数 ： N=5.54（t/w1/2）2
•影响分离效率的因素
• 焦耳热与温度梯度——电流通过而产生的热称 为焦耳热。受毛细管尺寸、溶液电导、外加电 压等影响
• 不均匀的温度梯度和局部的黏度变化会引起区 带展宽。温度变化1℃→黏度变化2%～3% →淌 度变化2%～3%
径小的物质有较高的淌度
•淌度
• 淌度——物理常数，是在溶质带最大电 量时测定并外推至无限稀释条件下的数 值，即绝对淌度
• 有效淌度——实验条件下测得的数值， 其取决于操作缓冲液的pH值和组成
•溶液pH值对淌度的影响
• 若两种溶质在完全离 子化状态下，具有相 同的电泳淌度，则因 没有差速迁移而不能 分离
• Tm=L·l/（ e + eof ）·V • （e + eof ）称为表观淌度a（即在电渗
流存在下测得的淌度）
• 溶质从进样点迁移至检测点所用的时间称 为“迁移时间(t)”，根据上式可计算溶质的 表观淌度：
• a =e＋ eof = L·l/t·V • 当L、l、V一定时， a与 t 成反比
二、分离度与理论板数
毛细管电色谱（CEC） 样品与固定相间相互作用
毛细管区带电泳（CZE）
• CZE是应用最广泛的一种技术，在毛细管内 充满缓冲液，不同质荷比大小的组分在电 场的作用下，根据迁移速度不同而达到分 离
• 缓冲液选择 –因电渗流（EOF）对pH值很敏感，故要求 采用缓冲液来维持恒定的pH值
•对缓冲液的要求
• 但若它们具有不同的 pKa值，则可调节溶 液pH值，使他们具有 不同的有效淌度，而 达到分离的目的
•电渗流（EOF）
• 毛细管电泳中的一个重要现象，是毛细管内壁表 面电荷所引起的管内液体整体流动的现象，是推 动来自百度文库体前进的驱动力
• 当固体与液体接触时，固-液两相界面上会带有相 反符号的电荷，形成双电层。对于石英毛细管柱 ，当溶液pH值达4以上时，其内壁带负电荷，管中 液体将感应一层正电荷，形成双电层，在高电压 作用下缓冲液整体向负极移动，此即电渗流 (eof)
• 电分散作用——样品区带与操作缓冲液的电导 差异可产生峰型畸变
•样品与缓冲液电导不匹配引起的电分散
高电导
等电导
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样品区带
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低电导
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溶质电导高于缓冲 液，产生前沿峰
–强缓冲能力，低的紫外吸收，小的淌度。 –常用的缓冲液有Tris（三羟甲基氨基丙烷
色谱毛细管电泳法
2020年5月17日星期日
概述
• 毛细管电泳又叫高效毛细管电泳 (HPCE)，是80 年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是 电泳技术与层析技术相结合的产物
• 广泛用于生物大分子，手性药物，生物体内的药 物及代谢物，中西药物及其制剂等的分析，在选 择性上与高效液相法有很大的互补性