核酸探针技术及应用.(精选)

核酸探针技术及应用

基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。

一、核酸探针技术的原理

DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。

核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。

二、核酸探针技术的基本方法

被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。探针亦可用3H标记，最后用液闪计数器计致。还可用生物素，抗生物素等标记，最后用酶标法显色，均能得到满意效果。

1 核酸探针的制备

核酸探针可分为DNA探针、CDNA探针、RNA探针和寡糖核苷酸探针，因其种类不同制备方法也不同。

1．1 DNA探针

DNA探针可分为基因探针和基因片段探针。全基因组基因探针的制备最简单，只要将染色体DNA分离纯化，然后进行标记即可。基因片段探针则需要将染色体DNA用限制性内切酶酶解，得到许多随机片段，然后与质粒重组，转化大肠杆菌(E·coli)，筛选含特异目的基因片段的克隆株进行扩增，再提取基因片段作探针。

1．2 CDNA探针

通过提取纯度较高的相应mRNA或正链RNA病毒的RNA，反转录成CDNA作为探针。也可以进一步克隆在大肠杆菌中进行无性繁殖，再从重组质粒中提取CDNA作探针。

1．3 RNA探针

有些双链RNA病毒的基因组在标记后，可直接用作探针。另一种是从CDNA 衍生而来的

RNA探针，可由很强的RNA聚合酶转录而得。其优点为CDNA探针所不及，由于RNA—RNA复合物比DNA—RNA复合物稳定，所以其灵敏度可提高10倍以上。

1．4 寡核苷酸探针

用DNA合成仪可以合成50个核苷酸以内的任意序列的寡核苷酸片段，以此作为核苷酸探针，也可将它克隆到M13系统中使之释放含探针序列的单链DNA，使探针的制备和标记简化。

2 核酸探针的标记

核酸探针过去采用放射性同位素进行标记，常用标记物有α32P dNTP，35S dNTP等。同位素的选择是依检测类型而定，制就的DNA探针先经加热变性成单链后再与固定于硝酸纤维素膜上的待测DNA杂交，如为同源则与之结合，经放射自显髟后，膜上出现黑色区。放射性同位素标记的优点是敏感度高，对被检样品处理要求不高，假阳性率小，且32P代替磷原予不改变碱基空间结构，所以不影响杂交反应的动力学曲线。其缺点是半衰期短，费用昂贵，同时需防护设备，另外放射自显影时问较长。因此近年来发展了非放射性标记，用于标记的非放射性物质有金属(如汞)，半抗原(如地高辛)，生物素。和酶等，应用较多的是生物素。非放射性标记的特点是保存时问长，检测时使用方便，其最大缺点是灵敏度一般比放射性同位素低，但最近报道用化学发光物吖啶酯直接标记DNA探针，用化学发光仪检测杂交体，其灵敏度超过放射性同位素标记的探针。可以予料化学发光物标记技术和均相杂交技术相结合可能是未来核酸探针分析技术的发展方向。

在这里介绍一种非放射性标记“生物素核酸探针”，其基本原理为：生物素(Biotin)是一种B族维生素，能与抗生素蛋白——亲和素(Avidin)或链霉亲和素(Streptavidin)特异性结合，其解离平衡常数(K D)为10-5。每个生物素分子由四个相同亚基组成，每个亚基都能专一性地识别一个生物素分子的脲基环部分。当生物素的戊酸侧链通过酰胺键与其他分子相连后，其脲基环保持与亲和素之一结合的能力，因而可通过生物素的戊酸侧链与待测目标相连。利用生物素和亲和素专一结合的特点，加入与荧光物质或酶相偶联的亲和素，去寻找被生物素所标记的目标，然后检测荧光或酶反应而检待测目标。

3 标本处理

首先从标本中提取DNA 作为靶源后方能用探针进行检测。提取DNA可用DNA提取仪，它是用一支包装的小柱于30分钟内快速提取DNA的仪器。标本经快速过柱后，达到纯化，DNA 加热变性使成单链 (RNA是单链勿需予先变性)采取标本可能是未知病原体悬液，亦可能是痰或粪便标本等。

目前已发展了不需抽提核酸而直接在细胞裂解液中进行检测的方法。用高浓度的硫氰酸胍直接使细胞裂解，并使细胞内所有蛋白质包括核酸酶变性，释放出核酸，使缠绕的DNA分子解缠绕，形成一个适宜直接杂交的液相环境，这样的标本处理方法不仅减少了工作量，而且容易掌握，国外在爱滋病的病毒检测中已应用这种方法对血细胞进行处理。

样品处理要考虑的另一个问题是待测样品中目的序列的含量或总的核酸量。如果古量太低必然会影响检测的灵敏度。解决的办法是用聚合酶链式反应(PCR)的方法，它能在体外通过DNA 聚合酶将目的序列的拷贝数特异地快速扩增1O5～107倍，使标本中目的序列的含量大为提高，便于检测。目前PVCR法已广泛应用于DNA诊断的各种技术中，在遗传病的产前诊断，传染病的早期诊断和法医物证鉴定中均取得了满意的结果。

4 核酸分子杂交

核酸分子杂交(nucleic acid bybridization)是指标记的单核苷酸和所需检测的目的单链核酸通过碱基配对互相结合的过程。若为双链核酸则事先需要变性，使之打开成单链。