组合生物学

二、组合生物合成法
（一）组合生物合成的基本程序：
【1】组合生物合成的基因操作 【2】组合生物合成的表达体系 【3】克隆生物合成的功能基因簇
【1】wenku.baidu.com因操作
• 组合生物合成的关键在于利用微生物体 内的DNA重组技术对催化新型化学结构 的蛋白质编码基因的遗传操作，可分为 PKSI型基因的组合操作和PKSII型基因 的组合操作
1）整个单元操作改变聚酮体链的长度： PKSI中结构单个ORF可以单独表达， 去掉特定的ORF可以改变链长。
2）替代LD改变生物合成起始单位： LD区域是PKS基因簇的操作靶点，用异源 LD域替代原LD域可以改变所接受的起始单元， 获得新的聚酮体。
3）前体定向生物合成： 由新的前提介导生物合成称前体定向生合 成。 4）AT域的互换 ： 这一步是操作重点，不同AT域识别不同的 延伸单位，所以相互代替或置换AT域可以产生 新的化合物
• 聚酮化合物是通过聚酮合酶 聚酮合酶(polyketide 聚酮合酶 synthase,PKS)催化形成的，其催化过程类似于脂 肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)催化的脂肪酸 生物合成，即通过酰基CoA活化的底物之间的重 复脱羧缩合而合成 • 目前已经揭示的聚酮合酶可以分为三类：Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型。研究和报道最多和较为透彻的是Ⅰ 型PKS，它是由几个多功能的多肽组成，每一个 多肽上都分别携带有参与聚酮生物合成所必需的 各种酶的结构域(domain)，每个结构域只参与整 个聚酮碳链构建中的一步生化反应(noninterative)， 而参与一轮聚酮生物合成反应的所有结构域称为 一个合成酶单位(SU,synthase unit)，编码这个合 成酶单位的DNA称为一个模块(module)。
(3) 聚酮合酶中模块的替换
在红霉素DEBS1模块1的N端，存在两个起始 加载结构域(ATL和ACPL)，它们负责红霉素合成 第一步反应――6dEB生物合成起始物丙酰CoA的 选择和加载，因此这两个结构域也被称为起始加 载模块(loading module，LM)。已知不同的起始 加载模块对底物的选择性不同，avermectin的起 始加载模块对起始物要求非常宽松，它可加载多 达40余种不同化合物作前体。Marsden用 avermectin的起始加载模块取代红霉素的起始加 载模块构建的糖多孢红霉菌突变体，通过添加不 同的前体合成了新的C13位为异丙基、2丁基等红 霉菌A、B和D衍生物(图3)。
目前，聚酮合酶Ⅰ型PKS组合生物学采用的技术： 目前，聚酮合酶Ⅰ PKS组合生物学采用的技术： 组合生物学采用的技术
（1）聚酮合酶中模块的减少 （2）聚酮合酶中模块的的增加 （3）聚酮合酶中模块的替换 （4）模块中结构域的减少 （5）模块中结构域的增加 （6）模块中结构域的替换 （7）前体指导下的新聚酮化合物的合成
可以从理论上来推算一下通过聚酮合酶的组合生物 学所衍生的聚酮化合物的潜力(CP,combinatory potential） CP=AT*[ATE*4]M AT代表负责加载不同起始合成单位的AT结构域；ATE代 表负责加载不同延伸合成单位的AT结构域；4代表由β酮 基的经不同结构域催化形成产物的可能性；M代表基因 簇中模块的数目。这还不包括AT两种立体化学可能性、 KR结构域两种立体化学可能性、加尾酶等其它可能增加 产物数量可能性的因素。以一个像红霉素这样典型的包 含6个模块的PKS基因簇为例，若含有3种类型的AT(识 别加载丙二酰CoA，甲基丙二酰CoA，乙基丙二酰CoA)， 那么可能形成的聚酮化合物的理论值就接近10000000， 这就为聚酮库的建立奠定了坚实的理论基础。
（4 ）模块中结构域的减少：
关于PKS基因工程改造的第一例成功的报道就是对红霉素PKS模 块5中KR结构域的缺失失活。在红霉素PKS模型提出时，为验证模型的 正确性，Donadio等通过同源重组同框缺失DEBS3中模块5的KR5结构 域的80个氨基酸，正如预料的那样，突变体合成了新的在C5位是酮基 的红霉素衍生物5，6dideoxy3αmycarosyl5oxoerythronolide B(图4)。这不 仅证实了6dEB生物合成模型的正确性，还给人们以极大的启示：在 DEBS中结构域的功能和结构是相对应的；DEBS以及6dEB后修饰酶对 底物的要求并不十分严格，突变产生的中间产物能被下游的结构域有 效的加工利用。另一个类似的实验是针对DEBS2模块4中烯酰基还原酶 结构域(ER4)的功能失活，它衍生的大环内酯中C6C7由单键变成了双键 ［40］(图4)。此外，还有一些关于使结构域功能丧失的成功报道，但 主要是集中于与还原功能有关的KR、ER、DH结构域，这是因为它们 决定了相应碳单位不同的还原程度，通过改变β酮基的还原程度可以产 生更多的杂合聚酮（图4)。
1.PKSI型基因的组合操作
Ⅰ型PKSs 的结构 62dEB 聚合酶由DEBS1 ,2 和3 组成,每个DEBS 由两个组块组成,每个组 块包含有催化缩合的活性亚基;酰基转移酶(AT) α, β, 2酮酰基载体蛋白 合成酶(KS)和酰基载体蛋白(ACP) ,同时有还原性活性亚基[β2酮基还原酶 (KR) ,脱水酶(DH) 和烯酰还原酶(ER) ] 。反应完成后,硫酯酶(TE) 负责聚 酮链从酶上解离
• 聚酮链合成的底物选择、还原程度和产物的立体 化学构型都是由PKS上相应模块中的结构域决定 的，每个结构域的功能都一一对应在最终产物的 结构上，这种多功能模块化PKS中催化活性中心 和化学合成步骤及终产物化学结构的一一对应关 系，使得通过编辑生物合成基因来设计杂合产物 成为可能，并由此产生出一个崭新的研究领域 ――聚酮合酶的组合生物学。 聚酮合酶的组合生物学
聚酮合酶的组合生物学就是通过基因工程
等相关技术人为地对产生抗生素等微生物次级代 谢产物合成途径进行合理的改造，由此产生非天 然的杂合基因或基因簇，从而形成新的非天然的 天然聚酮化合物，与传统组合化学的主要区别是 它是在基因水平上由微生物来合成自然界原本并 不存在的新化合物，而且这种化合物的数量是惊 人的。
5）β-碳链延伸域修饰的操作： 形成产物的多样性 6）单元连接序列的操作
以上这些可以是单个单元的操作，也可是两个、三 以上这些可以是单个单元的操作，也可是两个、 个单元分别改变后的组合操作。 个单元分别改变后的组合操作。
7）对聚酮体进行后修饰： 包括糖苷化与羟基化，修饰后才具有生 物活性 8）体外表达系统： 现已发展了体外表达DERS蛋白系统
三、组合生物合成中常用的 生物技术
1.抗性基因作为探针 由于抗性基因的克隆相对直接，以抗 性基因为探针，通过染色体步移克隆其 他结构基因和调节基因
2.“反向遗传学”法 这种方法是通过分离纯化代谢途径中 催化某一步反应的相关酶蛋白，经蛋白序 列分析后获得其中的一段氨基酸序列，以 此为模板设计简单并性寡核苷酸作为探针 进行基因文库的筛选
组合生物合成的研究原理图 Figure 1 Principle and strategy of combinatorial biosynthesis
（二）、组合生物合成的特点
• 天然产物的生物合成是由一系列的酶系作介导，由低级代 谢物作为起始物，经过一系列反应最终合成末端产物。组 合生物合成是通过操纵天然化合物合成途径中的基因产生 天然的天然同系物。 • 生物合成较之传统化学合成的主要优点在于环保，化学的 选择性和分子的多样性方面，生物合成的优势是酶有足够 的精确性修饰特点的位点，而不会导致副产物的产生，可 以改变那些化学方法所不能改变的分子基因
组合生物合成的主要特点：
1.组合生物合成可以产生大量化合物，可轻易产生许多类似物，可以将 同一系列的化合物“一网打尽”。 2.应用组合生物合成可以改变抗药生物原有的生物合成过程，使其结构 多样化。因此随着这一研究方法的不断发展，进一步理解一些重要次 级代谢产物的结构和功能的关系，将能够合成更多抗酸且对耐药性致 病菌具有活性的新的红霉素类物质，从而使更安全有效的药物不断出 现。 3.对一些现有结构复杂的天然产物的优先成分进行定向合成或者对临床 用抗生素品种进行有针对性的修饰和改造，如青蒿素，银杏内酯。例 如：对红霉素进行改造产生酮内酶型的大环内酯类抗生素，从而获得 对临床耐药性能有明显改善的天然产物或抗生素。 4.多基因组合操作的平台是以易于大规模生产的微生物体系为基础，使 创新型药物的研究更易产业化。
组合生物合成
——第五组
一、组合生物合成简介
（一）、组合生物合成的概念
• 指在了解微生物生物合成途径以及克隆有关生物 合成、调节等基因的基础上，在体外对这些不同 来源（种内或种外）的基因进行删除、添加、取 代以及重组，然后导入到一个适当的微生物宿主 中并定向合成所需的一系列化合物，例如新抗生 素或其他一些新的生理活性物质。它与组合化学 的主要区别是在基因水平上由微生物合成各种各 样的化合物。 • 它是利用天然产物生物合成机制获得大量新的 “非天然”天然产物的方法。
2.PKSII型组合生物合成的基因操作
•
图2
Ⅱ型PKSs 的结构 minimal PKS 包括酮基合成酶(KS) , 酰基载体蛋白(ACP) , 链长 因子(CLF) , 酰基转移酶(AT) ,酮基还原酶(KR) ,芳香化酶(ARO) ,环化酶 (CY
• 芳香族聚酮体，PKSII型基因作用机制研究还和不够，在 这里不做介绍
（1）聚酮合酶中模块的减少：
聚酮链的构成单位与催化它形成的PKS 模块是一一对应的，因此，聚酮链的长度 可以通过改变延长单位模块的数目来完成， 前提是最后一个模块和环化酶结构域必须 能够识别非天然的中间产物（图1）。
（2）聚酮合酶中模块的的增加:
在基因中添加模块直至2001年才获得 成功。Rowe等将来自S.hygroscopicus合成 雷帕霉素PKS的模块2、模块5分别插入截 短的DEBS1TE模块1和模块2之间，合成了 在相应位置多出一个结构单位的四酮化合 物；将雷帕霉素PKS的模块2、模块5分别 插入全长DEBS的模块1和模块2之间，则合 成了多出一个结构单位十六元环的聚酮化 合物(图2) 。
3.突变株互补法 主要是把野生型产生菌的DNA克隆到 有遗传诱变获得的突变株中，通过测定突 变株中填入产物的生产是否被恢复判断克 隆到的DNA是否与其生物合成有关，是一 种早期方法。
4.PCR扩增： 是根据同源基因的保守序列设计简单 性引导物，运用PCR扩增，从填入产物产 生菌中克隆生物合成基因，是目前普遍采 用的方法。 还有转座子中断克隆、同源基因作为探 针、异源表达克隆等。
四、聚酮类化合物及其组合生物合成
1、聚酮化合物及聚酮化合物酶
• 聚酮化合物是一大类由细菌、真菌和植物将低级 羧酸通过连续的缩合反应产生的天然产物，它包 括许许多多具有抑制细菌(如红霉素、四环素)、 真菌(如灰黄霉素、两性霉素)、寄生虫(如 avermectin、奈马克丁)、癌症(如多柔比星、 enediynes)等活性的化合物，有些抗真菌聚酮化 合物同时还具有免疫抑制剂的活性(如雷帕霉素、 FK506)，它被广泛地应用于医药、畜牧和农业。
【3】组合生物合成的表达系统
载体系统： 载体系统 理想的载体应具备稳定的复制子和选择 性标记。 宿主系统： 宿主系统 理想的宿主系统应是遗传学背景比较清楚， 使重组DNA可以轻易导入、回收和保持， 外源基因应能在其中充分表达及准确折叠 和进行翻译后加工
【3】克隆生物合成的功能基因簇
• 生物合成功能基因簇的克隆始于对一种链 霉菌的菌株DNA随机片段的克隆。对生产 特定抗生素的菌株，通过克隆使其成为突 变株，使抗生素的生物合成停滞在整个生 物合成途径中的某一步，常用的克隆生物 合成基因的方法有：将目的基因克隆到标 准宿主菌种，然后个别产物检测，克隆与 阻断突变株互补的基因等
（5） 模块中结构域的增加：
β酮基的还原程度不但影响聚酮碳骨架的多样性， 而且影响内酯 化的方式和以羟基为中介进行的其 A：红霉素全长DEBS； B：只包含 模块1、2和TE结构域的截短了的红霉素DEBS； C：只包含模块1、2、 3和TE结构域的 截短了的红霉素DEBS； D：只包含模块1、2、3、4、 5和TE结构域的截短了的红霉素DEBS 图1 聚酮合酶中模块减少示意图 A：只包含模块1、2和TE结构域的截短了的红霉素DEBS； B：在截短 了的红霉素DEBS模块1、2之间增加了一个来自雷帕 霉素PKS的模块 2(灰色区)； C：在截短了的红霉素DEBS模块1、2之间增加了一个来 自雷帕霉素PKS的模块5(灰色区)；D：红霉素全长DEBS； E：在全长 红霉素DEBS模块1、2之间增加了一个来自雷帕霉素PKS的模块2(灰色 区)； F：在全长 红霉素DEBS模块1、2之间增加了一个来自雷帕霉素 PKS的模块5(灰色区) 它官能团与聚酮的结合。KR结构域的增加或 KRDH结构域的增加或KRDHER结构域的增加，都有可能影响β酮基 的不同程度的还原而改变其它基团连接以及改变内酯环化的位点。 McDaniel等将红霉素PKS的模块2的KR替换为来自于雷帕霉素PKS的模 块4的DHKR，相当于模块2比原来多增加了一个DH结构域，使原有 的羟基发生了脱水，形成了C=C双键(图5)。