Klotho的研究进展

Klotho的研究进展*
常晋瑞1，△孙娜1南瑛1于玮1齐永芬2
（1西安医学院基础医学部生理学教研室，西安710021；2北京大学医学部基础医学院
生物活性小分子研究室，分子心血管学教育部重点实验室，北京100191）
摘要Klotho是新发现的一种抗衰老基因，其表达受多种因素的调控，如活性肽降钙素基因相关肽、成纤维细胞生长因子2等可以上调Klotho表达，而肾素-血管紧张素、尿毒素、炎症反应与氧化应激则可下调Klotho表达。

Klotho蛋白有膜结合型和分泌型两种形式。

现有研究表明，Klotho参与了多种疾病的发生发展，包括血管钙化、动脉粥样硬化、高血压、肾病损伤、甲状旁腺功能亢进、糖尿病及肿瘤等。

本文就Klotho的表达调控及其与疾病的关系简要作一综述。

关键词Klotho；调节因子；疾病
中图分类号Ｒ335；Ｒ332；Q74
Ｒesearch Progress of Klotho CHANG Jin-Ｒui1，△，SUN Na1，NAN Ying1，YU Wei1，QI Yong-Fen2（1Department of Physiology，Basic Medical College of Xi＇an Medical University，Xi＇a n710021，China；Bioac-tive small molecules Laboratory，Basic Medical College of Peking University Health Science Center，Key La-boratory of Molecular Cardiovascular Science，Ministry of Education，Beijing100191，China）
Abstract Klotho，a newly identified anti-aging gene，can be regulated by many factors，such as calcito-nin gene-related peptide，fibroblast growth factor2could up-regulate Klotho expression；whereas renin-angiotensin system，urinary toxins，inflammation and oxidative stress could reduce expression of Klotho．There are two forms of Klotho protein：membrane-bound Klotho and secreted Klotho．Existing studies showed that Klotho was involved in the development of many diseases，including vascular calcification，atherosclerosis，hypertension，kidney damage，hyperparathyroidism，diabetes and tumors．In this paper，the regulation of Klotho expression and its role in diseases are reviewed briefly．
Key words Klotho；regulators；diseases
1997年Kuro-o等在类似于人类衰老的小鼠模型上发现一种衰老相关基因，并采用古希腊神话中纺织生命之线的女神名字-Klotho命名［1］。

Klotho 基因缺失小鼠在出生后3 4周即表现出衰老现象，包括寿命缩短、生长停滞、血管钙化、动脉硬化、皮肤萎缩、骨量减少、肺气肿、听觉障碍、运动神经元变性、不育症和肿瘤发生等，在2月龄时因衰老死亡［1］。

而Klotho基因过表达可延长小鼠寿命（Kuro-su等．2005）。

近年研究发现，在一些病理状态下，Klotho的表达也会发生变化，而且与疾病的发展和预后密切相关［2］。

本文就Klotho表达调控、生理作用及其与疾病的关系研究作一简要综述。

一、调控Klotho表达的因素
大量研究发现，Klotho的表达可以受到多种因素的调节，如降钙素基因相关肽（calcitonin gene-re-lated peptide，CGＲP）、成纤维细胞生长因子2（fibro-blast growth factor2，FGF2）、促红细胞生成素、甲状腺激素、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）与过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAＲ-γ）等均可上调Klotho的表达，而内源性肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，ＲAS）和病理性尿毒素、炎症反应与氧化应激则可以下调Klotho表达。

（一）上调Klotho表达的因素
1．生物活性肽：CGＲP与FGF2CGＲP广泛分布于神经和心血管系统，具有保护内皮、舒张血管和抑制平滑肌细胞增殖等功能。

Zhou等在血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）诱导的骨髓来源内皮祖细胞衰老模型中发现，CGＲP和Klotho mＲNA的表达均降低。

应用CGＲP诱导剂吴茱萸碱或过表达CGＲP，可下调NADPH氧化酶和活性氧的产生，延
*国家自然科学基金（31400984，81270407）资助课题
△通讯作者
缓细胞衰老；若沉默Klotho基因，可逆转CGＲP的作用，提示CGＲP通过上调Klotho抑制细胞衰老［3］。

FGF2是一种分布广泛的促有丝分裂剂，能够调节骨发育与骨生长。

在FGF2转基因小鼠肾脏中，Klotho mＲNA及蛋白表达水平增加，提示FGF2过表达可能增加Klotho表达［4］。

2．激素：促红细胞生成素与甲状腺激素Sug-iura等在盐酸阿霉素诱导的大鼠肾病模型中发现，外源性给予人重组促红细胞生成素可逆转盐酸阿霉素诱导的肾组织Klotho水平降低，降低血肌酐和血磷水平，改善肾组织形态学变化［5］。

在离体实验中，应用10－7mol/L甲状腺激素可显著增加3T3-L1脂肪细胞中Klotho mＲNA表达水平（Mizuno等．2001）。

上述两项研究提示，促红细胞生成素和甲状腺激素也可能对Klotho具有上调作用。

3．生长因子EGF与转录因子PPAＲ-γ：Choi等通过使用启动子序列缺失构建方法发现，Klotho启动子区存在能被EGF诱导的活性区域，且早期生长反应元件因子1（early growth response factor1，Egr-1）结合位点位于此区域［6］。

若将Egr-1结合位点突变，EGF诱导Klotho转录的作用消失。

该研究提示EGF可能通过上调Egr-1启动Klotho转录［6］。

此外，在Klotho启动子区也被证实存在非经典的PPAＲ-γ反应元件，应用PPAＲ-γ激动剂亦可增加HEK293细胞和肾上皮细胞系Klotho mＲNA和蛋白水平，而应用PPAＲ-γ拮抗剂或敲低PPAＲ-γ后该作用消失（Zhang等．2008），提示转录因子PPAＲ-γ可调控Klotho的表达。

（二）下调Klotho表达的因素
1．ＲAS：Lin等（2010）在离体培养的NＲK-52E 细胞实验研究中发现，血管紧张素转换酶抑制剂福辛普利以时间依赖性而非剂量依赖性地上调Klotho 基因表达，且福辛普利可逆转Ang II下调Klotho的作用。

随后，Yoon等在环孢霉素A诱导的小鼠肾病模型中，发现Ang II受体阻断剂氯沙坦可逆转肾病小鼠Klotho表达的降低、降低氧化应激水平，且Klotho的表达水平与血管紧张素原和肾素表达水平具有相关性［7］。

2．尿毒素：Sun等分别给予尿毒症小鼠及离体肾小管细胞尿毒素吲哚酚处理，发现Klotho基因超甲基化，Klotho表达减少；而应用DNA甲基转移酶可减少尿毒素诱导的Klotho基因甲基化，增加Klotho表达［8］，提示尿毒素导致Klotho表达的减少可能是由于Klotho基因甲基化所致。

此外，尿毒素吲哚酚可以显著下调大鼠和离体肾小管细胞（HK2）中Klotho mＲNA和蛋白的表达，而给予抗氧化剂或核转录因子NF-κB抑制剂可以减轻吲哚酚的这一效应（Shimizu等．2011），提示吲哚酚通过激活NF-κB和氧化应激下调Klotho表达。

3．炎症反应：在三硝基苯磺酸、微生物、过继性转移T细胞诱导的三种小鼠肠炎模型上，均存在肾组织Klotho表达降低，且降低程度与肠炎严重程度相关；使用肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）抗体可逆转炎症诱导的Klotho表达降低（Thurston等．2010）。

Moreno等（2011）在离体培养的肾小管MCT细胞系实验中发现，TNF通过NF-κB 依赖的机制下调Klotho表达。

4．氧化应激：Mitobe等在内髓集合管细胞（mIMCD3）中发现过氧化氢可浓度依赖性地下调Klotho mＲNA和蛋白表达，而过表达Klotho可减少过氧化氢诱导的细胞凋亡［9］，提示氧化应激可下调Klotho表达。

二、Klotho的生物学活性
抗衰老蛋白Klotho具有多种生物学活性，一方面膜结合型Klotho与成纤维细胞生长因子受体（fi-broblast growth factor receptor，FGFＲ）作为FGF23的共受体，介导FGF23的生物学活性；另一方面分泌型Klotho可抵抗氧化应激、抑制细胞炎症和凋亡；此外，分泌型Klotho蛋白还具有促进血管发生、调控离子通道和增强骨骼肌力度等作用。

（一）膜结合型Klotho
1．调节代谢稳态：FGF23是人体内功能最强大的调磷激素之一。

FGF23虽可与多种FGFＲ相结合，但只有在膜受体Klotho的辅助作用下，才能特异性地介导FGF23功能。

FGF23通过下调肾近端小管腔面膜上II型钠磷共转运体（Na-phosphate co-transporter2，Npt2）的表达，促进磷的排泄，从而在调节磷代谢稳态中发挥重要作用［10］。

Klotho基因突变小鼠出生后3周时，血浆中钙、1，25-（OH）2-VD
3
水平显著增高，其机制可能是通过调节1α羟化酶基因的表达来实现（Tsujikawa等．2003）。

（二）分泌型Klotho
1．抗氧化应激和细胞凋亡：机体代谢产生的活性氧类物质是造成细胞损伤的重要原因，该损伤被称为氧化应激。

Nagai等在Klotho基因突变小鼠中发现，伴随着小鼠认知功能的障碍，海马组织中脂质过氧化和DNA过氧化水平升高，细胞凋亡增加；而应用抗氧化剂后可减轻认知障碍、脂质过氧化和细
胞凋亡，提示Klotho对氧化应激发挥重要调节作用［11］。

2．抑制炎症：Maekawa等用Klotho蛋白和致炎细胞因子TNFα共处理脐静脉内皮细胞，发现Klotho可抑制TNFα诱导的细胞间黏附分子和血管细胞黏附分子的表达上调，并抑制NF-κB活化和IκB磷酸化，同时抑制TNFα诱导的单核细胞向内皮细胞黏附［12］，提示Klotho可直接抵抗致炎细胞因子的炎症作用，保护内皮功能。

此外，Liu等在Klotho缺失小鼠和离体衰老人脐静脉内皮细胞实验模型中发现，细胞内Klotho可与衰老细胞中视黄酸诱导基因1相互作用，并抑制视黄酸诱导基因1诱导的炎症因子白介素6（interleukin6，IL-6）和IL-8的表达［13］，证实Klotho可以抑制衰老相关的炎症反应。

3．抑制内质网应激：Banerjee等发现给予人肾上皮细胞HK-2内质网应激诱导剂衣霉素或毒胡萝卜素后，HK-2细胞发生内质网应激反应；而过表达Klotho后内质网应激标志物被显著下调［14］。

使用siＲNA敲低HEK293细胞中Klotho后，衣霉素或毒胡萝卜素可诱发更为剧烈的内质网应激反应，并导致细胞凋亡［14］，提示Klotho具有抑制内质网应激的作用。

4．调控离子转运：Klotho除负性调控1，25-
（OH）
2-VD
3
的生成外，还可调节细胞膜上一些载体
和离子通道的稳定性和数量。

Almilaji等发现Klotho可显著增强非洲爪蟾卵母细胞中电压门控钾通道Kv1．3的蛋白水平和细胞膜中Kv1．3的电流［15］。

与野生型小鼠相比较，Klotho敲低小鼠肾脏集合管Na+/K+ATP酶的蛋白表达水平显著降低，膜片钳实验显示用Klotho蛋白处理爪蟾卵可增加Na+/K+离子通道电流，提示Klotho对Na+/K+ATP 酶的表达和功能有调节作用（Sopjani等．2011）。

Alexander和Cha等分别在Klotho基因敲除鼠和离体肾小管上皮细胞中发现，Klotho可调节Ca2+与K+在肾脏中的离子转运（Alexander等．2009，Cha 等．2009）。

5．调节生长激素的分泌：Klotho基因缺陷小鼠生长发育迟缓，提示Klotho可能参与生长激素的调节。

给予小鼠腹腔注射Klotho后，血清中生长激素分泌量显著增加，这可能与Klotho解除了胰岛素样生长因子-1对生长激素的负反馈调节有关（Shah-moon等．2014）。

6．促进血管发生：2004年Shimada等将Klotho 基因突变鼠单侧后肢动脉结扎造成缺血损伤，发现突变鼠下肢骨骼肌组织毛细血管密度较野生型小鼠显著减少［16］。

主动脉环培养实验证实突变鼠血管发生受损，内皮一氧化氮（nitric oxide，NO）释放减少，而且缺血组织中骨髓和外周血来源的内皮祖细胞数目显著减少［16］。

7．增强骨骼肌力量：Semba等测定了年龄大于等于65岁的804例受试者握力和血浆中Klotho水平，发现Klotho水平低于681pg/mL时，两者呈显著正相关。

该结果提示老年人骨骼肌力量的下降与血浆中Klotho表达水平较低有关［17］。

8．调节听力：Carpinelli等发现Klotho基因敲除鼠表现为听力的轻度丧失，其表型与老年性耳聋相似。

使用不含VD3的饮食喂养Klotho基因敲除鼠可使血浆中1，25-（OH）2-VD3水平恢复正常，并且抑制听力丧失的发生［18］。

Klotho基因敲除鼠听力丧失与肾脏中1α-羟化酶的表达升高导致1，25-（OH）
2
-VD
3
过量产生有关［18］。

三、Klotho与疾病的关系
（一）血管钙化Klotho基因敲除鼠存在显著的血管钙化［1］，提示Klotho的缺失可能参与了血管钙化。

Hu等发现慢性肾病小鼠存在严重的软组织钙化，且Klotho表达显著减少；而慢性肾病的Klotho 转基因小鼠，钙化减轻［19］。

离体培养平滑肌细胞实验进一步证实，Klotho可抑制钠依赖的磷摄取，抑制高磷诱导的钙化和表型转变，提示Klotho缺失参与了慢性肾病中软组织的矿化和血管钙化［19］。

Klotho 基因敲除鼠肾近端小管Npt表达增加；Klotho和Npt 双敲可减轻Klotho单敲诱导的小鼠软组织钙化（Ohnishi等．2009）。

Jimbo等发现FGF23可加速过表达Klotho基因的大鼠血管平滑肌细胞钙化［20］。

以上研究均提示Klotho参与了血管钙化过程中钙磷代谢，对软组织和血管钙化具有一定的调节作用。

（二）动脉粥样硬化Klotho基因突变小鼠发生动脉粥样硬化和内皮损伤，提示Klotho可能参与了内皮保护作用［1］。

Yu等对ApoE敲除小鼠行5/6肾切除术诱导肾衰，6周时肾功能衰竭小鼠主动脉斑块面积明显增加，主动脉根部斑块面积和主动脉胆固醇含量明显增高，血浆尿素、总胆固醇和甘油三酯浓度异常增高，而肾和血浆中Klotho蛋白表达水平显著下降，表明尿毒症动脉粥样硬化的发生伴随Klotho表达的下调［21］。

相反，腺病毒转染Klotho基因可减轻Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty （OLETF）动脉粥样硬化大鼠内皮功能失调，增加
NO产生，降低血压（Saito等．2000），提示Klotho可改善动脉粥样硬化。

Kuwahara与Yoon研究团队分别在慢性抑制一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）诱导的大鼠动脉粥样硬化模型与环孢霉素诱导的大鼠肾病模型上，发现他汀类药几乎完全逆转肾病大鼠Klotho表达的降低，从而改善动脉粥样硬化斑块和肾损伤（Kuwahara等．2008，Yoon等．2012），提示他汀类药可通过增加循环或肾组织中Klotho含量而改善动脉粥样硬化和肾损伤。

（三）高血压Wang等于2010年比较了215例原发性高血压病人和200例非高血压人群的基因型分布，发现人Klotho基因G-395A位点多态性可能参与原发性高血压的发病［22］。

Su等发现老年高血压患者血清中Klotho蛋白水平显著低于老年非高血压患者，该结果提示老年高血压的发生可能与内源性Klotho减少有关［23］。

动物实验发现，自发性高血压大鼠肾组织中Klotho表达被抑制、肾小管萎缩、肾小球萎陷、胶原沉积；过表达Klotho基因后上述现象逆转，同时过表达Klotho可升高血浆IL-10水平，下调Nox2表达、降低NADPH氧化酶的活性和超氧阴离子的产生（Wang等．2009），提示Klotho 通过抑制氧化应激降低血压。

（四）肾病损伤血浆中Klotho主要来源于肾脏分泌，慢性肾功能衰竭病人肾组织中Klotho表达显著减少（Koh等．2001），提示Klotho的缺乏可能参与了肾功能衰竭的发生。

Deng等在链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病肾病模型上发现，肾病大鼠Klotho表达被显著抑制，而过表达Klotho可预防肾脏肥大和肾纤维化，减少肾胶原纤维产生［24］，与此同时，下调Ｒho相关蛋白激酶（Ｒho-associated coiled-coil kinase，ＲOCK）的表达与活性，提示Klotho可减轻糖尿病大鼠肾脏肥大和纤维化，其机制可能与抑制ＲOCK信号通路相关。

在Ang II诱导的大鼠肾损伤模型上，应用腺病毒转染Klotho，亦可改善肌酐清除率、尿蛋白及小管间质的组织形态学变化（Mitani等．2007），进一步证实Klotho具有保护肾病损伤的作用。

（五）甲状旁腺功能亢进生理情况下，FGF23作用于甲状旁腺的受体FGFＲs和共受体Klotho，抑制甲状旁腺激素的分泌，维持钙磷稳态［25］。

Taka-hashi等发现，严重的继发性甲状旁腺功能亢进症患者血清中FGF23水平较健康人显著升高，而血浆Klotho水平显著降低，行甲状旁腺切除术后伴随FGF23、钙、磷、甲状旁腺激素水平下降，Klotho水平在术后第一天也出现下降，随后呈现一负反馈式的上升过程［26］。

该研究提示Klotho缺失可能参与了甲状旁腺功能亢进的发生。

（六）糖尿病在临床上PPAＲ-γ激动剂如罗格列酮、匹格列酮等被用来改善糖尿病的糖代谢异常及后续的糖尿病肾病。

Chen等在链唑霉素诱导的糖尿病大鼠模型中发现，大鼠压力反射降低。

口服罗格列酮7天后，大鼠压力反射恢复，脑组织中Klotho水平上升，推测压力反射的恢复可能与罗格列酮刺激糖尿病大鼠脑组织中Klotho水平升高有关［27］。

Cheng等进一步利用链唑霉素诱导的1型糖尿病大鼠模型发现，肾组织中Klotho蛋白表达降低；外源性应用胰岛素降低血糖的同时，不仅可上调肾中Klotho蛋白水平，还可改善肾功能（Cheng等．2010）。

（七）肿瘤Zhou等报道乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤组织中Klotho的蛋白表达水平较正常组织降低，而且Klotho表达下调可能导致肿瘤细胞增殖、凋亡减少，提示Klotho可能是一个肿瘤抑制因子［28］。

Li等在人结肠癌组织中发现，Klotho蛋白表达水平显著性降低，且Klotho表达下调与肿瘤浸润和较晚的肿瘤分期相关。

相反，在离体结肠癌细胞中过表达Klotho后，肿瘤细胞生长和增殖受到抑制，该过程可能与Klotho抑制胰岛素样生长因子-1介导的细胞增殖信号通路有关［29］。

此外，Zhu等（2013）和Chang等（2012）分别报道Klotho作为肿瘤抑制因子，可显著抑制肾细胞癌和宫颈癌的发生发展。

上述研究提示，Klotho具有广泛的抗肿瘤活性，或可作为未来抗肿瘤靶点用于肿瘤的治疗。

（八）缺血性卒中Majumdar等对印度460例缺血性卒中病人及574例年龄、性别相匹配的正常对照人群进行基因分型发现，40岁时Klotho KL-VS 纯合子基因型人群较杂合子人群缺血型卒中的发病率高1．5至3倍，而在50岁年龄组则没有差异［30］。

提示Klotho基因变异可能参与早期缺血性脑卒中的发生。

此外，Kim实验室对韩国女性缺血性卒中病人进行了基因分型分析，同样发现Klotho基因变异是缺血性卒中一个重要的危险因子（Kim等．2006）。

四、结语
综上所述，Klotho基因是一种抗衰老基因，该基因的缺失可表现出类似于人类的衰老现象。

受多种因素调控的Klotho具有丰富的生理和病理生理学作用，参与了多种疾病的发生发展过程。

鉴于
Klotho具有广泛并重要的生物学保护作用，然而其确切的保护机制尚不清楚，值得予以高度关注和深入研究。

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