基因编辑技术及其在畜牧业中的应用研究进展_李莉

网络出版时间：2016-11-29 08:33:07

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评述与展望

Review and Progress

基因编辑技术及其在畜牧业中的应用研究进展

李莉 毕延震 华再东 任红艳 肖红卫 刘西梅 郑新民*

湖北省农业科学院畜牧兽医研究所, 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室, 武汉, 430064

* 通讯作者,***************

摘 要 基因编辑技术为畜牧业进行新型分子育种开创了新天地，传统的转基因技术由于整合位点不可控、遗传不稳定等因素而难以在畜牧业发挥作用。胚胎干细胞(ES细胞)和同源重组(HR)相结合可以做到定点整合、稳定遗传，但因为畜禽干细胞难以获得而无法推广。以锌指核酸酶(ZFN)、TALEN和CRISPR/Cas9为代表的新型基因编辑技术结合体细胞核移植(SCNT)以及显微注射技术，为畜禽遗传改良开辟了新思路。

本研究综述了ES结合HR的传统基因编辑技术和ZFN、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和成簇有规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)以及其相关蛋白(Cas9, Cpf1)的研究及其在畜禽基因编辑中的应用进展。

关键词 基因编辑技术, 同源重组, 锌指核酸酶, TALEN, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1

Developments and Application in Animal Husbandry of Gene Editing Technology

Li Li Bi Yanzhen Hua Zaidong Ren Hongyan Xiao Hongwei Liu Ximei Zheng Xinmin *

Hubei Key Lab of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding, Institute of Animal husbandry and veterinary, Hubei Academy of Agriculture Science, Wuhan, 430064

*Correspondingauthor,***************

Abstract Classic transgenic technology couldn’t play its great role in animal breeding because of randomly integration and unstable heredity of exogenous genes. A new world has been opened for molecular breeding of animals by gene editing. Embryonic stem (ES) cells and homological recombination (HR) could make targeted integration and stable heredity of introduced genes, but this technique was difficult to apply owing to unavailable ES cells in farm animals. New path was developed for molecular breeding in the farm animals by the new gene editing technologies including the zinc finger nuclease (ZFN), the transcription activator-like effector nuclease (TALEN) and the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system (CRISPR/Cas9) combine with somatic cell nuclear transfer (SCNT) and/or pronuclear microinjection. The progress and applications of ES cells combined with HR, ZFN, TALEN, CRISPR and related proteins (Cas9, Cpf1) in farm animals were reviewed in this study.

Keywords Gene editing, HR, Zinc finger nuclease, TALEN, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1 随着分子生物学的发展，现代生物技术在畜牧业中的应用日趋广泛，如分子辅助育种和转基因技术育种等。自从DNA和DNA工具酶的发现，分子克隆和分子操作日益广泛，二者的结合诞生了一个全新的研究领域——转基因动物。第一例转基因动物就是用显微注射的方法把疱疹病毒胸苷激酶基因转入小鼠(Gordon et al., 1980)。随后，在1982年诞生了“超级鼠”，该超级小鼠携带有转入的生长激素基因，比对照生长速度快(Palmiter et al., 1982)。超级鼠的诞生极大的刺激了转基因技术在家畜育种中的研究和应用，全世界的科学家都希望通过转基因技术获得高产低耗的优良品种。随即，诞生了转基因鱼(Zhu et al., 1982)、猪、绵羊、兔(Hammer et al., 1985)、牛(Church, 1987)等动物。我国通过设立“863计划”，于20世纪90年代初采用显微注射的方法，获得了高表达生长激素(pGH)的转基因猪(Wei et al., 1993)。由于显微注射的技术和设备要求高、耗时耗力，一些新的基因转移方法得以应用，如基因枪法、精子载体法、逆转录病毒介导法等(Mu et al., 2014)。但随着研究的深入，人们发现通过上述方法获得的转基因动物存在诸多缺陷，如外源基因整合效率低下，整合位点难以控制，导致转基因的效果不理想；而且转入的外源基因会随着传代次数的增多而减少，不能稳定遗传(Wei et al., 1993)。因此，寻求新的基因修饰及转移技术成为打破上述瓶颈的必由之路。

研究发现DNA的双链断裂(DSB)可以引起DNA的修复，DNA的修复机制包括同源重组(HR)和非同源末端结合(NHEJ)。同源重组是以同源序列为模板进行精确的修复，NHEJ是简单的断裂DNA末端的连接，常导致局部缺失、插入，甚至无关联位置末端连接而导致染色体异位(Wyman and Kanaar, 2006; Yan and Lai, 2015)。科学家们一直在寻求更高效的基因打靶技术以期望能够取代传统的同源重组技术，最近几年新兴的工程核酸酶介导基因编辑技术——锌指核酸酶(ZFN)，以ZFN为基础的类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)，成簇的有规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白(Cas9和Cpf1)，这些能够制造特定位点DSB的技术，理论上可以对任意细胞类型的任意基因进行定点改造，称之为基因编辑技术。这些技术主要由识别特异序列位点的识别域和切割基因组的核酸酶组成。新的基因编辑技术大大提高了传统的同源重组技术的效率，使得小鼠以外的动物基因编辑得以实施和应用。

1传统的基因重组技术与胚胎干细胞

同源重组(Homologous Recombination, HR)技术可以克服外源基因整合位点随机和不能稳定遗传等问题。但是，同源重组在培养细胞中的效率极低，约10-7 (Shulman et al., 1990)。哺乳动物因为产卵量小，难以直接采用受精卵或生殖细胞建立同源重组的转基因动物。因此，HR不能应用于基因功能的体内研究和转基因育种。而胚胎干细胞(ES细胞)的诞生改变了这一现状，因为ES细胞具有全能性，打开了动物基因编辑之门。Evans和Kaufman在1981年首次获得小鼠胚胎干细胞(Evans and Kaufman, 1981)。该途径然而，到目前为止，仅有小鼠和大鼠的ES细胞培养获得成功(Evans and Kaufman, 1981; Buehr et al., 2008; Nowak-Imialek and Niemann, 2012)。小鼠和大鼠ES细胞能够进入种系，繁育后代；其它胚胎干细胞只能称