不同地区大豆根瘤菌培养条件的优化

jun, XU Xiuhong (College of Res ources and Environmental S ciences , Northeas t Agricultural Univers ity, Harbin 150030, China )
Abstract: Environme nt of s oil is the prima ry fa ctor a ffe cte d nodula tion of Rhizobia , a nd its type , pH a s we ll a s othe r phys ica l a nd che mica l prope rtie s ca n influe nce the e ffe ct of Rhizobia inocula tion. The re fore , it is ne ce s s a ry for Rhizobia from diffe re nt re gions to optimize culture conditions in orde r to e ns ure tha t the inocula tion of Rhizobia ca n produce a la rge numbe r of e ffe ctive nodule s , re a ch high production purpos e s . Rhizobia from Ha ilun, S uiling, Be ia n, Hula n a nd S uihua we re inve s tiga te d for
pH
图 2 pH 对大豆根瘤菌生长的影响
Fig. 2 Effect of pH on Rhizobia growth
海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根 瘤菌最适 pH 分别为 6.0、7.5、6.5、8.0、6.5。其
第 11 期
李郑军等：不同地区大豆根瘤菌培养条件的优化
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OD 值 Values of optical density
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东北农业大学学报
第 40 卷
1 材料与方法
1.1 菌种 本实验室分离纯化得到的海伦、绥棱、北安、
呼兰和绥化地区的大豆根瘤菌。 1.2 培养基
除有特殊说明之外，以下培养基、试剂和营养 液在配制时均用蒸馏水定容至 1 000 mL，121 ℃灭 菌 30 min，若是固体培养基则再加入 2%（W/V）琼 脂粉。
的含量，且增产效果在 10％以上[4]。然而土壤环境是 影响根瘤菌结瘤固氮的首要因素，其类型、pH 以及 其他理化性质都能影响根瘤菌的接种效果。针对不 同土壤的理化特性筛选出抗逆性强的优良根瘤菌菌 株作为接种剂是仍需研究的一个问题[5]。因此有必要 对不同地区大豆根瘤菌的培养条件进行优化，针对 不同地区的土壤和大豆品种选择最适宜的根瘤菌作 为接种剂，才能获得最佳的增产效果[6]。
收稿日期：2009-03-20 基金项目：中国科学院知识创新工程重大项目（KSCX1-YW-09-09-03）；黑龙江省科技计划项目（KT05A400-1）；哈尔滨市科技攻关计 划项目（2007AA6CN105）；东北农业大学创新团队发展计划项目（CXT003-2-1） 作者简介：李郑军（1983-），女，硕士研究生，研究方向为微生物学。 * 通讯作者：许修宏，教授，博士生导师，研究方向为食用菌、微生物肥料、微生物除草剂。E-mail: howard2857@hotmail. com
菌种活化：取1 环菌种接入斜面培养基，28 ℃ 培养 48~72 h，用作活化菌种。
种子培养：取 1 环斜面菌体接种于种子培养基 （250 mL 三角瓶装液量为 40 mL），28 ℃、180 r·min-1 恒温振荡培养 24~48 h。
发酵培养：按 2%的接种量吸取种子培养基接 种于发酵培养基（250 mL 三角瓶装液量为 40 mL） 恒温振荡培养。 1.3.2 大豆根瘤菌培养条件的优化
OD 值 Values of optical density
2.05
◆
1.88
◆
◆
■
◆
■
◆
■
◆ 海伦 Hailun
■
1.55
■
*▲
■ 绥棱 Suiling
1.30 *▲
▲* ▲* ▲ ▲ 北安 Beian
* × 呼兰 Hulan
1.05 × 0.80
×
×
×
× * 绥化 Suihua
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Key words: Rhizobia ; culture time; pH; rotate s peed; temperature
生物固氮在提高土壤肥力、改变土壤的物理性状 和生物学性状方面具有比较明显的效果[1]，不仅具有 良好的经济效益和社会效益，而且还能在可持续农业 中维持良好的生态环境，具有明显的生态效益[2]。可 以说豆科固氮的意义不仅能够为作物提供营养元素， 而且在改善作物生态环境方面为土壤微生物研究者提 供了新的视角[3]。应用大豆根瘤菌接种技术，使植物 根部产生大量有效根瘤，不但能够提高籽粒中蛋白质
第 40 卷 第 11 期 2009 年 11 月
东北农业大学学报 Journal of Northeast Agricultural University
40(11): 11~13 Nov. 来自百度文库009
不同地区大豆根瘤菌培养条件的优化
李郑军，许修宏*
（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）
◆ 海伦 Hailun ▲◆ ■ 绥棱 Suiling
▲ 北安 Bei′an *■× × 呼兰 Hulan
斜面固体培养基：甘露醇 10.0 g，酵母膏 3.0 g， Na2SO4 0.2 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl·2 6H2O 0.1 g，1%干果红。种子液体、发酵液体培养基： 甘露醇 10.0 g，酵母膏 3.0 g，Na2SO4 0.2 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl2·6H2O 0.1 g。 1.3 方法 1.3.1 培养方法
160、180、180 r·min-1；培养温度均为 28 ℃。
关键词：大豆根瘤菌；培养时间；pH；转速；温度
中图分类号：S144.3
文献标识码：A
文章编号：1005-9369（2009）11－0011－03
Optimization on culture conditions of Rhizobia in different areas/LI Zheng-
obta ining the optima l culture conditions by s ingle fa ctor. The re s ults s howe d tha t the optima l culture conditions we re a s be low: culture time wa s , 48, 48, 48, 96 a nd 48 h, re s pe ctive ly; initia l pH wa s 6.0, 7.5, 6.5, 8.0, 6.5, re s pe ctive ly; rota te s pe e d wa s 180,180, 160, 180, 180 r·min-1, re s pe ctive ly; culture te mpe ra ture of a ll the Rhizobia wa s 28 ℃.
96 120 144 168 192
培养时间（h） Culture time
图 1 培养时间对大豆根瘤菌生长的影响
Fig. 1 Effect of cultural time on Rhizobia growth
2.2 pH 值对大豆根瘤菌生长的影响 海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根
瘤菌分别在最佳培养时间，培养温度 28 ℃，转速 180 r·min-1 时，pH 值对其生长的影响见图 2。
OD 值 Values of optical density
对 pH 的适应能力表现出不同的趋势。海伦地区的 大豆根瘤菌对 pH 值的变化趋势不大；而绥棱地区 和呼兰地区的大豆根瘤菌对弱碱性的适应能力较 强；北安和绥化地区的大豆根瘤菌在 pH 6.0~7.5 的变化趋势大体一致，而在 pH 7.5~8.0 的变化趋势 却不同，北安地区的大豆根瘤菌 OD 值随着 pH 值的 增加而上升，而绥化地区的大豆根瘤菌 OD 值则随 着 pH 值的减少而下降。培养基的初始 pH 值是影响 微生物生长的主要因素，太高或太低均不利于菌体 生长。这是由于一方面不适合的 pH 值会引起微生 物表面电荷的改变，从而不利于细胞对营养物质的 吸收；另一方面 pH 的改变会让有机化合物离子化， 不利于有机化合物渗入细胞，继而影响微生物细胞 的运输机制，促进或妨碍一些营养物质的吸收。 2.3 转速对大豆根瘤菌生长的影响
海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根 瘤菌分别在最佳培养时间，最佳 pH 值，培养温度 28 ℃时，转速对其生长的影响见图 3。
豆根瘤菌分别在最佳培养时间，最佳 pH 值，最 佳转速条件下，培养温度对其生长的影响结果见 图 4。
2.5
2.0
◆ ▲
1.5
1.0 *■×
▲◆ ■× *
▲◆
■× *
◆▲ *■×
摘 要：土壤环境是影响根瘤菌结瘤固氮的首要因素，其类型、pH 以及其他理化性质都能影响根瘤菌的接
种效果。因此有必要对不同地区大豆根瘤菌的培养条件进行优化，使大豆接种根瘤菌，能够在植物根部产生大量
有效根瘤，达到增产目的。研究通过单因素试验分析得到海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化的大豆根瘤菌的最佳培
养条件。培养时间分别为 48、48、48、96 和 48 h；pH 分别为 6.0、7.5、6.5、8.0、6.5；转速分别为 180、180、
取分离纯化后的大豆根瘤菌菌株，对培养时 间 、 pH、 转 速 和 培 养 温 度 进 行 单 因 素 条 件 优 化 。 培养时间分别选取：24、48、72、96、120、144、 168、192 h；pH 分别选取：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0； 转速分别选取：140、160、180、200、220 r·min-1； 培养温度分别选取：22、25、28、31、34 ℃。将不 同培养条件下的大豆根瘤菌培养液在紫外分光光度 计上测定 OD600 值，确定不同地区大豆根瘤菌的最 佳培养条件。
OD 值 Values of optical density
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5 0
◆▲*■× *▲■× ◆▲ *■×
0 24
◆ ◆▲ ▲■
■
* *× ×
48 72
◆
▲
▲◆
▲ ◆
■× ■× × * * *■
◆ 海伦 Hailun ■ 绥棱 Suiling ▲ ▲ 北安 Bei′an *◆× × 呼兰 Hulan ■ * 绥化 Suihua
2 结果与分析
2.1 培养时间对大豆根瘤菌生长的影响 当 pH 7.0、培养温度 28 ℃，转速 180 r·min-1
时，培养时间对不同地区大豆根瘤菌生长的影响 见图 1。在 0~24 h 内，不同地区的大豆根瘤菌均 处于延滞期，生长较为缓慢。此时大豆根瘤菌接
种到新鲜培养基中后，为了适应新的环境，菌株自 身进行代谢的适应性调整；24~48 h 内除呼兰地区 的大豆根瘤菌外其余均处于对数生长期，而呼兰地 区的大豆根瘤菌在 24~96 h 内处于对数生长期。这 是由于细胞的代谢活性急剧增强，生成大量组成新 细胞的物质，因而菌株的繁殖速度加快；随后则出 现较明显的差异性，海伦地区的大豆根瘤菌在 48~ 96 h 内处于稳定期；绥棱地区的大豆根瘤菌在 48~ 120 h 内处于稳定期；北安和绥化地区的大豆根瘤 菌在 48~144 h 内处于稳定期；呼兰地区的大豆根瘤 菌在 96~144 h 内处于稳定期；在此之后，不同地区 的大豆根瘤菌均处于衰亡期，菌体开始自溶。可能 是由于液体培养基中的某些变化引起的，比如液体 培养基中营养物质的减少、甚至是有害代谢产物的 积累等。因此确定海伦、绥棱、北安、呼兰、绥化 的最佳培养时间分别为 48、48、48、96 和 48 h。