抗重金属霉菌的筛选鉴定及其特性研究

第30卷第1期2007年3月 辽宁师范大学学报(自然科学版)Journal of Liaoning Normal University (Natural Science Edition ) Vol.30　No.1Mar.　2007 文章编号:100021735(2007)0120100204

抗重金属霉菌的筛选鉴定及其特性研究

姜　华1,　魏晓晴1,　胡晓静2

(1.辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连　116029;2.辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连　116001)

收稿日期:2006209208基金项目:辽宁省教育厅资助项目(2004D217)

作者简介:姜华(19582),女,黑龙江富裕人,辽宁师范大学教授,博士.E 2mail :jianghua1225@

摘　要:采用微生物学法,通过生物耐受性诱导驯化,从污水处理厂活性污泥中分离到了能抗重金属镉、

铬、砷、汞和铅的4株霉菌,鉴定为变幻青霉、桔黑青霉、淡紫拟青霉和链格孢霉.经原子吸收光谱及原子荧光光度计检测证明,4

种霉菌对As 5+的耐、抗性强,对Hg 2+的耐、抗性弱.对As 5+的耐、抗性高达1.0g/L ,对重金属离子去除率可达40%.

这些抗性微生物有望应用于被重金属污染的水体及土壤.

关键词:重金属污染;霉菌;微生物修复

中图分类号:Q939.96 文献标识码:A

据统计,全球每年释放到环境中的有毒重金属高达数百万吨.重金属能使土壤质量下降、降低农产品产量与品质、恶化水体环境,并通过食物链进入人体,对生态环境及人类健康造成严重危害[122].因此,有效控制重金属元素在环境中扩散、污染,已成当务之急.对重金属污染的处理,传统的物理和化学等方法因为成本高、产生二次污染、对较低浓度的重金属离子处理效果不明显等弊病[3],其应用越来越受到限制.微生物修复法能够快速高效吸附重金属离子,在低浓度下处理重金属的效果更佳,具有吸附容量大、速度快、选择性好、无二次污染、成本低等特点,越来越受到人们的重视[4].目前,为了修复重金属污染,抗性菌株的筛选和育种已成为该领域研究的热点,但国内这方面的研究尚处于起步阶段,相关报道较少.本实验通过生物耐受性诱导驯化,从污泥中筛选得到了4株抗5种金属离子镉、铬、砷、汞、铅的霉菌,并检测了菌株对这几种重金属离子的去除效果,以期获得修复重金属污染的高效菌株,为工业化生产提供重要菌种.

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　菌株来源　活性污泥采自大连第一污水处理厂污水处理池;土样采自鞍山钢铁厂内及辽宁师范大学校园内锅炉房旁的土样.

1.1.2　主要仪器　Z —8000原子吸收分光光度计(日本日立公司)、A FS2201双道原子荧光光度计(北京海光仪器厂)、电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂)、摇床(中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司)、数控式湿热灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、高速离心机(江苏省金坛市医疗仪器厂)、显微镜(日本奥林帕斯公司).

1.1.3　主要试剂　硝酸镉、重铬酸钾、砷酸钠、氯化亚汞、醋酸铅等.重金属离子盐试剂均采用国产化学纯.

1.1.4　培养基　马铃薯200g (沸水30min 的浸出汁),葡萄糖20g ,蒸馏水1L ,p H 自然;重金属筛选培养基是在基础培养基中分别加入不同种类、不同浓度的重金属盐.

1.2　抗性菌株的诱导驯化及筛选

首先使用初筛培养基进行固体和液体逐级驯化培养,采用平板稀释法分离抗性菌落,初筛培养基所含重金属浓度分别为0.005,0.01,0.02,0.05,0.1g/L.初筛得到的抗性菌落再逐级分别接种到固体和液体的复筛培养基中(重金属浓度逐级加大为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0g/L ).培养温度为28℃,液体培养于150rad/min 摇床.筛菌流程为:活性污泥—富集培养—平板划线初筛—多次纯化及传代培养—复筛—稳定高效抗重金属菌种.记录霉菌数量和形态特征.重复3次.

1.3　抗性菌株的重金属离子最低抑菌浓度(MIC)的测定

取1mL 菌悬液加入到49mL 不同浓度的重金属离子液体培养基中(重金属浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0g/L ),28℃、150rad/min 振荡培养3d 后,涂平板计数[526].重复3次.

第1期

姜　华等:　抗重金属霉菌的筛选鉴定及其特性研究101　1.4　重金属去除率测定取1mL 菌悬液加入到49mL 含重金属离子(Hg 2+:0.4g/L ,Pb 2+、Cr 6+、Cd 2+:0.6g/L ,As 5+:0.8g/L )的液体培养基中,28℃、150rad/min 摇床液体培养3d 后,8000rad/10min 离心,取上清液测定重金属离子含量.采用石墨炉原子吸收光谱法测定铅、镉、铬的含量,采用氢化物2原子荧光光谱法测定砷和汞含量.沉淀物干燥后称菌体干重.

去除率=(K -M )/K 吸附量=去除率/G

(K :空白对照组重金属离子含量;M :菌处理组重金属离子含量;G:菌体干重)[7].重复3次.选取去除率高的为目的菌种.

1.5　抗性菌株对重金属离子去除实验条件的选择

采取单因素试验法进行p H 值、培养温度、培养时间等环境因素影响目的菌株对重金属离子吸附量的测定[8].每处理重复3次.首先,将目的菌株接种到不同p H 值(3,4,5,6,7,8,9,10,11)培养液中,28℃、120rad/min 摇床液体培养3d 后8000rad/10min 离心,取上清液检测重金属离子含量,取沉淀称菌体干重,计算重菌株对金属离子的吸附量.将每种

目的菌株置于各自的最适p H 条件下(其他处理相同),分别进行不同培养温度(22、24、26、28、30、32、34、36、38、40℃

)、不同培养时间(12、24、36、48、60、72、84、96、108、120h )的菌株对重金属离子吸附量的测定.重复3次.

1.6　菌体可溶性糖含量的测定

取重金属离子溶液处理前后的菌液,离心后称量菌体湿重,用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[9210].重复3次.

2　结果与分析

2.1　抗性菌种的筛选与鉴定

在所采的土样中都存在有特异性抗重金属的霉菌,且活性污泥中种类和数量较多.本实验经初筛分离得到霉菌抗Cd 2+的16株、抗Cr 6+的18株、抗As 5+的22株、抗Hg 2+的12株、抗Pb 2+的17株特异性霉菌.经复筛分离得到抗性更高的霉菌:3株抗Cd 2+的菌株Cd 21、Cd 22和Cd 24,3株抗As 5+的菌株As 22、As 26和As 212,1株抗Cr 6+的菌株Cr 215,1株抗Pb 2+的菌株Pb 23及2株抗Hg 2+的菌株Hg 22、Hg 27.由真菌分类专家吕国忠教授利用光学显微镜,依据菌落、菌体形态特征进行直接观察分类,其鉴定结果认为:Cd 21、As 22、As 212是同一菌株,均为变幻青霉(Penicilli um variabile Sopp );As 26、Pb 23均为变幻青霉(Penicilli um variabile Sopp )、桔黑青霉(Penicilli um cit reoni g rum Dierckx )、淡紫拟青霉(Paecilom yces lilacinus (Thom )Samson )、链格孢菌(A lternaria alternata (Fr.)Keissler ).4株霉菌见图

1.

图1　4种霉菌图

从左至右依次为变幻青霉、桔黑青霉、淡紫拟青霉、链格孢菌

2.2　重金属离子最低抑菌浓度的测定

图2　Pb 2+离子浓度对霉菌菌落数的影响随着重金属离子浓度的增大,培养基中菌落数大致呈下降趋

势.以Pb 2+浓度对霉菌菌落数的影响曲线(如图2所示)为例说

明:随着Pb 2+浓度的增大,4株霉菌存活的菌落数大致呈下降趋

势.开始时4条曲线均有一个平台,说明重金属浓度较低时,对霉

菌的生长繁殖影响不大.浓度继续升高,当达到一个临界值时,重

金属离子对菌体产生较为严重的毒害,菌体的生长繁殖明显受到

抑制,菌落数急剧下降.不同菌株的临界浓度有所不同:变幻青霉

和淡紫拟青霉的临界浓度约为0.2g/L ,链格孢菌约为0.1g/L ,

桔黑青霉的临界浓度最大,约为0.4g/L.其中桔黑青霉对Pb 2+

的耐受性最好,浓度为1.0g/L 时,其存活率仍有3%,其余3种菌的存活率均小于0.1%.随着Pb 2+浓度的进一步增大,下降趋势趋于平缓,原因是:随着Pb 2+浓度的增加,菌群中的大部分敏感细胞被Pb 2+抑制,仅有数耐受性好的细胞存活,菌体数量变化趋于稳定[11].其余4种重金属离子浓度对霉菌菌落数的影响曲线与Pb 2+的曲线相似,因此略.