中药毒理学研究

（二）高脂饲料喂养法 SD大鼠——给普通饲料5－10天——血清——测定血脂正常值——
分组——高脂饲料并给予不同的药物处理——每周测血脂1次（2－4 周）
高脂配方主要成分： 猪油、蛋黄粉、胆固醇、甲基硫氧嘧啶、胆酸钠
＋ 基础饲料
1.脂类含量 ——造模天数 2.SD大鼠＜ Wistar大鼠 3. 稳定性差。
两种
拟临床给药途径 静脉注射
灌胃给药
大鼠 20ml/kg 小鼠 40ml/kg
3
七、观察时间与观察指标 1．观察时间 持续观察30分钟——1-4小时各一次——2周——记录毒性反应
的特点，出现时间、消失时间、死亡只数。
2．观察指标 体重、外观、毛色，活动、呼吸 死亡解剖
3.最大耐受量试验 指动物在最大体积和浓度的条件下， 不产生死亡的最大给药量的试验。
中药毒理学研究
概念
研究中药对生物体的损害及其毒性作用机理的一门 学科。
研究目的：
（1） 发现中药的毒性反应 （2） 确定毒性作用的剂量范围 （3） 确定中药毒副作用的靶组织或靶器官 （4） 判断毒性的可逆性 （5） 研究解毒药及药物中毒后的解救措施
中药进行毒性试验的必要性：
纯天然观念 传统¡ª¡ª汤剂¡ª¡ª口服
实验设计
四、实验动物的选择：
小鼠和大鼠。雌雄各半，小鼠为18~22g。 温度：23℃±3℃ 湿度：30%~70%，通风良好，笼具应清洁。
五、剂量和分组 1.找出0%及100%估计致死量。 2. 以一定的剂距（1︰0.6~0.85）上下各推二组确定预试验的剂
量分组。 3.改良寇氏法
六、给药方式和给药容量
糖尿病
1型 10% 胰岛素依赖型
12
糖尿病
2型 90% 非胰岛素依赖型
1型糖尿病的动物模型
1.手术 切除胰腺 犬 结扎胰管
高糖饮食——胰岛B细胞 ——1型糖尿病
1型糖尿病的动物模型
2.化学物质破坏胰岛β细胞 四氧嘧啶—超氧自由基—B细胞内DNA损伤—mRNA 功能受损——合成胰岛素
腹腔注射 方法：大鼠给予1%一5%的四氧嘧啶一次
意义
1.了解中药急性毒性的强弱 2.为长期毒性试验及特殊毒性试验选择
剂量提供依据 3.获取毒性反应信息
实验计
2
一、试验管理 执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。 二、试验设计 符合¡± 随机、对照、重复¡±的原则。 三、试验药品 采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的 中试样品。
3. 拟用临床剂量法（ACD） 3个月
大鼠 50-100倍、25-50倍、10-20倍 狗 30-50倍、15-25倍、5-10倍
六、给药途径和周期 与临床拟用药途径相同。
长期毒性试验的给药周期 临床疗程
≤1周 ≤2周 ≤1个月 ≤3个月 >3个月
七、观察指标 1、一般指标
长期毒性给药周期 啮齿类动物
④2级：内膜斑块占管腔面积的1/2； ⑤内膜斑块占管腔面积大于1/2； ⑥4级：管腔几乎全被斑块堵塞。 光镜和电镜：观察内膜泡沫细胞数及中膜完整平滑肌层数。
（三） 其它分析的指标 计算肝系数：动物每100g体重含肝重克数。 观察肝组织学改变：肝脏的脂肪变性和泡沫细胞数镜检分级。 测定脂质过氧化物（LPO）和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。 血液流变学指标（浓、黏、凝、聚状态）。
（三）蛋黄注射法（急性模型） 鸡蛋黄 + 生理盐水——75%蛋黄乳液——雄性小鼠
腹腔注射0.5ml/只——注射后20小时——测定血清
11
三、客观指标
（二）形态学检查 病例切片：观察冠状动脉斑块病变程度 ①0级：冠状动脉内膜无脂质浸润； ②0.5级：冠状动脉内膜轻度脂质浸润； ③1级：内膜斑块占管腔面积的1/4；
16
谢谢
17
5、器官重量：肝脏、心、肾脏、性腺、脑、肾上腺、甲状腺、垂体和 胸腺。 脏器系数=脏器重量/动物体重*100%
6、病理检查 7、恢复性观察 8、数据处理及结果分析
长期毒性试验 局部毒性试验
局部给药：经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、 静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等途径给药。
一、实验动物的选择
10
大鼠：模型制造方法简单，成本适中，采血量大。 小鼠：造模成本低，血量少。 鹌鹑、家鸽：制作容易。 兔：离人类渊源较近，是更理想的动物模型。
二、动物模型
（一）降脂药对正常动物初筛 正常大鼠——给药四天——第五天取血测——测定总胆固醇。 下降率%=（给药前浓度－给药后浓度）/给药前浓度×100%
局部给药的毒性：指上述非口服给药制剂用药后对用药局部产生的毒性 和对全身产生的毒性。
一、皮肤毒性试验
药物经皮肤吸收的两条途径
皮肤吸收试验（定性）
皮肤吸收定量试验
6
7
8
9
1.特殊性试验包括哪些研究内容? 2.简述微核试验的原则及实验要点。 3.身体依赖性试验有哪几种方法？ 2009.4
中药对高脂血症的药效研究方法
2.小剂量注射SZI加特殊膳食诱导
3.催肥法 神经性糖尿病 注射金硫葡萄糖¡ª¡ª破坏下丘脑内侧核¡ª¡ª 饱食中枢¡ª¡ª贪食¡ª¡ª催肥¡ª¡ª高血糖
肥胖雌性小鼠一次腹腔注射¡ª¡ª金硫葡萄糖 800 ms/kg¡ª¡ª血糖升高
4.注射激素 糖皮质激素、生长激素——促进糖原异生,抑制外周组织葡萄
4.糖原合成测定 葡萄糖 多余的
供能和转化 糖原储存于肝脏、肌肉
糖尿病动物——糖原合成 ——血糖
蒽酮法
5. 糖异生 氨基酸、乳酸、甘油和丙酮酸
糖尿病动物——糖异生
葡萄糖和糖原
6.血胰岛素水平（机制研究） 磺酰脲类——刺激胰岛β细胞分泌胰岛素 双胍类——作用于外周组织，对血胰岛素无影响 胰岛素增敏剂——改善组织细胞对胰岛素的敏感性
（200 mg/kg）
尾静脉 ——24 h后高血糖
（90 mg/kg）
1型糖尿病的动物模型
链尿酶素(SZI) 一次大剂量—速发型糖尿病—胰岛B细胞直接受损 多次小剂量—迟发型糖尿病—T淋巴细胞介导(可能)
正常动物——注射链尿酶素 72小时 测定血糖
3.自发性糖尿病动物模型 中国地鼠——先天胰岛β细胞受损——胰岛素缺乏——血糖升高
2周 1个月 3个月 6个月 6个月
非啮齿类动物 2周
1个月 3个月 6个月
9个月
5
体征、外观、行为、食欲、恶心、呕吐、大小便等。 2、血液学指标 HGB/RBC/HCT/WBC/PLT计数和分类 凝血时间
3、血生化指标 AST、ALT、ALP、CREA、BUN、TP、ALB、GLU、T-BIL TC、TG 4、尿分析 外观、比重、PH值、尿糖、尿胆原、尿胆红素、酮体
4
三、试验药品 采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的 中试样品。
实验设计
四、试验动物的选择 要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种。 Beagle狗，大鼠 五、剂量和分组 1．半数致死法（LD50法）
大鼠 1/10、1/50、1/100的LD50
2. 最大耐受量法（MTD法） 1MTD、1/3MTD、1/10MTD
13
——类似1型糖尿病
1型糖尿病的动物模型
4.病毒诱导 鼠脑炎病毒
成年小鼠胰岛B细胞脱颗粒—
柯萨奇病毒
胰岛B细胞破坏—1型糖尿病模型
2型糖尿病的动物模型
1. 特殊膳食诱导 过量 高蛋白 高脂 高糖
饮食动物—— β细胞萎缩 —— 2型糖尿病
给动物喂高热量饲料——8~10周——动物肥胖、高血脂、高 胰岛素血症及胰岛素抵抗。
研究方法
急性毒性试验 长期毒性试验
局部毒性试验
致畸试验 致癌试验 致突变试验 药物依赖试验
体内试验——利用整体动物进行的试验。
体外试验——利用离体脏器、培养细胞
进行的试验。
中药毒理学
药政管理学
中药药动学
分子生物学
细胞生物学
统计学
急性毒性试验
概念
急性毒性试验：中药一次或24小时内多次给予试验动物，观察在短时 间内对动物所引起的快速而剧烈的中毒效应的试验方法。
概念
长期毒性试验
长期毒性试验:试验动物连续多日接触较大剂量的药物所引起的 中毒效应。
目的
①发现药物蓄积、毒性作用。 ②推测靶器官或靶组织。 ③预测安全范围。 ④为临床试验中的解毒或解救措施提供参考信息。
实验设计
一、试验管理 执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。 二、试验设计 符合¡± 随机、对照、重复¡±的原则。
葡萄糖
淀粉
禁食动物——不同间隔时间采血测定血糖
蔗糖
计算血糖曲线下面积
（AUC）
3.糖化蛋白水平 蛋白质 ＋ 葡萄糖——糖基化 神经损伤 ＋ 修复生长因子受阻——不可逆的神经损害 血红蛋白——周围组织供氧不足 红细胞——血管堵塞——眼底和肾脏的缺血. 纤维蛋白——纤维蛋白大量沉积 眼晶状体蛋白——白内障
注射剂 胶囊剂
现在¡ª¡ª剂型改变¡ª¡ª口服液
中药进行毒性试验的必要性：
①中药成分复杂¡ª¡ª有效成分、赋形剂、杂质 澄清剂、增溶剂等
②新技术、新工艺应用于中药研究¡ª¡ª有效成分、有效部位及 其制剂 ¡ª¡ª某些成分含量明显提高毒性作用增大
1
现在的中药不同于传统意义上的中药
研究内容
一般毒性试验 特殊毒性试验
14
糖的利用——降低胰岛素作用
肾上腺皮质素模型建立法：
肾上腺皮质激素500ug/kg腹腔注射
大鼠
葡萄糖1g/kg的溶液灌胃
离体模型
离体模型
离体模型
离体模型
离体模型
四、客观指标
（一）糖代谢的指标
1.降血糖作用的量效和时效关系测定
给药组
阳性组
给药后不同间隔时间采血—测定血糖
阴性组
15
2.糖耐量测定