Plcd1转基因小鼠的制备

基金项 目： 国 家 自然科 学 基金 项 目（ ３ １ ０ ７ １ ０ ９ ２ ） ； 浙 江 省 公 益 性 技 术 应 用 研 究 计 划 项 目（ ２ ０ １ ２ Ｃ ３ ７ ０ ８ ４ ） ； 浙 江 省 大 学 生 科 技 创 新 活 动计 划 （ 新苗人才计划） ２ ０ １ １ Ｒ ４ ２ １ ０ ２ ９ ．
１ 材 料 与方 法
１ ． １ 材 料
１ ． １ ． １ 质粒、 细 胞 和 动 物
ｐ ＭＤ１ ９ 一 Ｔ载体 购于 Ｔａ Ｋａ Ｒａ ； ＤＨ５ ａ大肠 杆菌 购 于上海 生 工 ； ｐ Ｅ Ｆ ６ ／ Ｖ５ 一 Ｈｉ ｓ — Ｌ ａ ｃ Ｚ表达 载 体 由 中科 院
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ２ — １ ０ — １ ５
注射 ６ ８ １枚 受 精 卵 ， 在８ ２只 仔 鼠 中获 得 转 基 因 阳性 首 建 鼠 ｌ ５只 ， 其中 １ ３只 稳 定 遗 传 并 建 系 ． Ｐ Ｌ Ｃ Ｄ１ 一 ＨＩ Ｓ融 合
蛋 白在 睾 丸 组 织 中表 达 ， 在 皮 肤 组 织 中无 表 达 ． Ｐｌ ｃ ｄ ｌ转 基 因小 鼠为 Ｐ ｌ ｃ ｄ ｌ功 能 研 究 奠 定 了基 础 ．
第 ｌ ２卷第 １ 期
２ ０ １ ３年 １月
杭州 师范 大学 学报 （ 自然科学 版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｈ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｎ ｏ ｒ ｍ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ （ Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）
磷脂 酶 Ｃ （ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ｏ ｌ ｉ ｐ ａ ｓ ｅ Ｃ，Ｐ Ｌ Ｃ ） 是 磷 酸 肌 醇 途 径 的关 键 酶 之 一 ． 它水解磷脂酰肌 醇 ４ ， ５ 一 二 磷 酸
（ Ｐ Ｉ Ｐ ２ ） 产 生第 二信使 ： 肌醇 １ ， ４ ， ５三磷 酸 （ Ｉ Ｐ ３ ） 和 二脂 酰甘油 （ ＤＡ Ｇ） ， 分 别介 导 蛋 白激 酶 ｃ（ Ｐ ＫＣ ） 和胞 内 ｃ ａ 抖 库 的释放 ｌ － １ ］ ． 在 哺乳 动物 Ｐ Ｌ Ｃ超家 族 中 ， 依据 结构 和 调 节 活性 机 制 ， 可分 为 六 类 十三 种亚 型 ， 分 别 为
３ ．江 苏 大 学 实验 动物 中心 ， 江苏 镇江 ２ １ ２ ０ １ ３ ）
摘 要 ： 通过制备 Ｐ ｌ ｃ ｄ ｌ转 基 因 小 鼠 研 究 Ｐｌ ｃ ｄ ｌ基 因功 能． 首先逆 转录 Ｐ Ｃ Ｒ获 得 约 ２ ． ２ ｋ ｂ的 Ｐｌ ｃ ｄ ｌ基 因 全长 ， Ｔ载体克隆后测序验证 ； 以ｐ ＭＤ １ ９ － Ｔ — Ｐｌ ｃ ｄ ｌ为 模 板 ， 通过 设计 引物及 Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 引 入 酶 切 位 点 ， 与ｐ Ｅ Ｆ ６ ／ Ｖ５ 一 Ｈｉ ｓ同时 进 行 酶 切 、 连接 ， 构建 ｐ Ｅ Ｆ ６ ／ Ｖ５ 一 Ｈｉ ｓ — Ｐ ｌ ｃ ｄ ｌ表 达 载 体 ； 经真 核表达 验证后 ， 酶 切 获 得 目标 片 段 ， 显 微
因其 蛋 白结构 简单 ， 分 布广 泛 ， 具 有重 要 的生物 学功 能 ， 颇 受研 究者 的重 视． Ｐｌ ｃ ｄ ｌ已被证 实 与冠 状 动脉 痉 挛、 脂肪代 谢 及肿瘤 形 成与转 移 等密切 相关 ． ２ ０ ０ ３年 Ｎａ ｋ ａ ｍｕ ｒ ａ等 制 备 了 Ｐ ｌ ｃ ｄ ｌ敲除 小 鼠 ， 表 现 为被 毛
通信作者 ： 吴宝金（ １ ９ ６ ９ 一） ， 男， 教授 ， 博士 ， 主要 从 事 人 类 疾 病 小 鼠模 型 及 分 子遗 传 学 研 究 ． Ｅ － ｍａ ｉ ｌ ： ｂ ａ ｏ ｊ ｉ ｎ ｗｕ ＠１ ６ ３ ｐ Ｅ Ｆ ６ ／ Ｖ５ 一 Ｈｉ ｓ — Ｐ ｌ ｃ ｄ ｌ ； 显微注射 ； 转 基 因小 鼠
中图 分 类 号 ：Ｑ ９ ５ — ３ ３ 文献 标 志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：１ ６ ７ ４ － ２ ３ ２ Ｘ（ ２ ０ １ ３ ） ０ １ － ０ ０ ０ １ － ０ ７
稀疏 且 易发肿 瘤 ． ２ ０ ０ ８年 Ｒｕ ｎ ｋ ｅ ｌ 等［ ５ ］ 鉴定 出一 种稀 毛伴 雄 性不 育 的 ｏ ｌ ｔ ／ ｏ ｌ ｔ 小 鼠， 经 遗传 互 补 实验 证 明 ，
稀 毛表 型 为 Ｐｌ ｃ ｄ ｌ缺 失所 致． ２ ０ ０ ９年 吴 宝 金 等 通 过 Ｅ ＮＵ 诱 变 获 得 一 种 隐 性 遗 传 的 稀 毛 小 鼠 ｓ ｎ ｔ ｈ ｒ ， 其 突变 基础 为 Ｐ ｌ ｃ ｄ ｌ基 因的缺失 ． 现 有 资 料 显示 Ｐｌ ｃ ｄ ｌ基 因缺 失 的小 鼠均 伴 有 显著 的被 毛稀 疏， 而Ｐ ｌ ｃ ｄ ｌ高表 达会 出 现何种 表 型 尚未 可知 ． 本 实验 通过 显微 注 射方 法建 立 Ｐｌ ｃ ｄ ｌ转基 因小 鼠 ， 期望 为 Ｐｚ ｃ 基 因功能 的深 入研究 奠 定基础 ．
Ｖｏ ｌ ＿ １ ２ ＮＯ ． １
Ｊ ａ ｎ． ２ ０ １ ３
Ｐ ｌ ｃ ｄ ｌ转 基 因小 鼠 的 制 备
杨伟 伟 ， 殷筱 舒 ， 殷 黎静。 ， 张艳 丽 ， 李 高天 ， 刘桂 杰 ， 俞 利 平 ， 顾 关儿 ， 吴 宝金
（ １ ．杭 Ｊ ， ｔ １ 师 范大 学 实 验 动 物 中心 ， 浙江 杭州 ３ １ ０ ０ ３ ６ ｝ ２ ． 山东 省 青 岛第 十 七 中学 ， 山东 青 岛 ２ ６ ６ ０ ３ １ ；
Ｐ Ｌ Ｃ — Ｊ ３ ｌ 一 ４ 、 Ｐ Ｌ Ｃ 一 ７ ｌ 一 ２ 、 Ｐ Ｌ Ｃ ３ １ ， ３ － ４ 、 Ｐ Ｌ Ｃ 一 ￡ 、 Ｐ Ｌ Ｃ 一 和 Ｐ Ｌ Ｃ 一 ｑ － ｌ ， ２ 剖． Ｐｌ ｃ ｄ ｌ （ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ｏ ｌ ｉ ｐ ａ ｓ ｅ Ｃ ｄ ｅ ｌ ｔ ａ １或 Ｐ Ｌ Ｃ 一 ３ １ ）