发酵工程在现代生物技术中的应用
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1. 完全排除锅内冷空气 2. 灭菌完毕后要缓慢减压 3. 压力降为零后打开盖子
二、辐射灭菌法
利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物
以紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能 起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗 力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和 无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超 过1.2 m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于 液体物料的灭菌。
基因工程菌的制备
2.cDNA法 又称反转录法，从细胞内提取目的基因
的mRNA，在反转录酶的作用下，以 mRNA反转录互补的cDNA。 3.人工合成
在电脑控制下通过合成仪合成获得的 DNA片段。
二、载体的准备
目前常用的基因克隆载体：
1.质粒：严密性质粒和松弛型质粒
2.pBR322和pUC：去除原有质粒的非 必须功能，引入选择标记和在适宜的位 置设置限制酶单一切点。
⑵ 漂白粉
漂白粉的化学名称是次氯酸盐(次氯酸钠， NaOCl)，它是强氧化剂，也是廉价易得的灭 菌剂。它的杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯 酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧 和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对 杀死细菌和噬菌体均有效。
⑶ 75％酒精溶液
75％酒精溶液的杀菌作用在于使细胞脱水，引 起蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉菌 孢子均有杀死作用，但对细菌的芽孢杀死作用 较差。常用于皮肤和器具表面杀菌。
实际应用时，对一些要求保持干燥的实验 器具和材料可以采用干热灭菌法。
湿ห้องสมุดไป่ตู้灭菌法
利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。
其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞 中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特 别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微 生物死亡。
由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热 芽孢杆菌来说，温度升高10 ℃时，灭菌速度常 数可增加8～10倍，对营养细胞更高。
牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。
湿热灭菌法
间歇灭菌法
反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微 生物营养体和芽孢的目的。
操作步骤：100℃，30-60min；37℃，1h； 同上重复三次…
适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶 牛奶培养基。 方法简单，但却麻烦；工作周期长。
湿热灭菌法
高压蒸汽灭菌法
发酵工程在现代 生物技术中的应用
生物技术：应用自然学和工程学的 原理，依靠生物作用剂的作用将生 物物料进行加工以提供产品和为社 会服务的技术。
20世纪70年代以后，以DNA重组 技术的建立为标志，形成了一个以 基因工程为主导，发酵工程为中心， 包括细胞工程和酶工程的现代生物 技术体系。
第一节 基因工程菌发酵
´-OH末端上添加寡聚T，那么另一DNA片
段的3 ´-OH 末端上一定添加与T互补的 寡聚A。
四、目的基因导入受体细胞
取决于是否用合适的受体细胞、合适的 克隆载体和合适的基因转移方法
2、干热灭菌法
进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化， 微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起 中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死 亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受 力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温 度要高，时间要长，一般160～170℃， 1～1.5h。
使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅内 蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增高， 温度也随之增高，从而提高杀菌力，缩短 灭菌时间。
最有效而广泛应用的灭菌方法 实验室常用的是0.1MPa，121℃，
15～30min
应用范围
培养基，水，发酵罐等其他不适 合干热灭菌的物品。
高压蒸汽灭菌法的注意事项：
3.噬菌体载体 有λ噬菌体和M13噬菌体
三、基因与载体的连接
外源DNA与载体DNA之间连接方式：
1.粘性末端连接
先用一种酶切割外源DNA并将拟插入 的那个片段用凝胶电泳分离出来，再用 同一种酶去切载体DNA，这样可以通过 粘性末端连接起来。
2.平末端连接
3.在DNA片段末端加上均聚寡核苷酸后 连接：末端核苷酸转移酶能催化DNA末 端的3 ´-OH上添加单核苷酸的反应，形成 寡聚核苷酸连，如果在一个DNA片段的3
三、化学药品灭菌法
某些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、 酶失活、细胞通透性）而具有杀菌的作用。
化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操 作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。
化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的 不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸 等。
⑴ 高锰酸钾
高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨基 酸氧化，使微生物死亡，一般用0.1％～0.25 ％的溶液。
⑷ 新洁尔灭
新洁尔灭是表面活性剂类洁净消毒剂。它在水 溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌 体外膜损伤和蛋白变性。10 min能杀死营养细 胞，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。一般用 于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤剂 合用，不能接触铝制品。
⑸ 甲醛
甲醛(HCHO)是强还原剂，它能与蛋白质的 氨基结合，使蛋白质变性，对氨基和蛋白质的 变性有较强活性，这是用甲醛作为灭菌剂的根 据。使用时可以以2份37％甲醛溶液与1份 KMnO4混合，或者将37％甲醛溶液直接加热， 产生气态甲醛用于灭菌。甲醛灭菌的缺点是穿 透力差。
一、基因工程技术 通过对核酸分子的插入、拼
接和重组而实现遗传物质的重新组 合，借助载体将重组的目的基因转 移新的宿主细胞体系，并使目的基 因在新的宿主体系细胞中进行复制 扩增和表达所需的目的产物。
基因工程菌的制备
一、目的基因的制备 1.鸟枪法 选用合适的内切酶，在Mg2+的激活 下，切开供体DNA链获得目的基因，根 据酶切末端特点分为a、b两类。
蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是 目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条 件为121 ℃，30 min。
湿热灭菌法
煮沸灭菌法
将要消毒的物品放入水中煮沸（100℃）15～ 20min，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但 不能杀死芽孢。
巴氏消毒法
法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消毒 法。加热到62℃，经过30分钟，以杀死不耐高温 的物质中的微生物和病原体的消毒法。
二、辐射灭菌法
利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物
以紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能 起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗 力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和 无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超 过1.2 m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于 液体物料的灭菌。
基因工程菌的制备
2.cDNA法 又称反转录法，从细胞内提取目的基因
的mRNA，在反转录酶的作用下，以 mRNA反转录互补的cDNA。 3.人工合成
在电脑控制下通过合成仪合成获得的 DNA片段。
二、载体的准备
目前常用的基因克隆载体：
1.质粒：严密性质粒和松弛型质粒
2.pBR322和pUC：去除原有质粒的非 必须功能，引入选择标记和在适宜的位 置设置限制酶单一切点。
⑵ 漂白粉
漂白粉的化学名称是次氯酸盐(次氯酸钠， NaOCl)，它是强氧化剂，也是廉价易得的灭 菌剂。它的杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯 酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧 和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对 杀死细菌和噬菌体均有效。
⑶ 75％酒精溶液
75％酒精溶液的杀菌作用在于使细胞脱水，引 起蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉菌 孢子均有杀死作用，但对细菌的芽孢杀死作用 较差。常用于皮肤和器具表面杀菌。
实际应用时，对一些要求保持干燥的实验 器具和材料可以采用干热灭菌法。
湿ห้องสมุดไป่ตู้灭菌法
利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。
其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞 中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特 别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微 生物死亡。
由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热 芽孢杆菌来说，温度升高10 ℃时，灭菌速度常 数可增加8～10倍，对营养细胞更高。
牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。
湿热灭菌法
间歇灭菌法
反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微 生物营养体和芽孢的目的。
操作步骤：100℃，30-60min；37℃，1h； 同上重复三次…
适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶 牛奶培养基。 方法简单，但却麻烦；工作周期长。
湿热灭菌法
高压蒸汽灭菌法
发酵工程在现代 生物技术中的应用
生物技术：应用自然学和工程学的 原理，依靠生物作用剂的作用将生 物物料进行加工以提供产品和为社 会服务的技术。
20世纪70年代以后，以DNA重组 技术的建立为标志，形成了一个以 基因工程为主导，发酵工程为中心， 包括细胞工程和酶工程的现代生物 技术体系。
第一节 基因工程菌发酵
´-OH末端上添加寡聚T，那么另一DNA片
段的3 ´-OH 末端上一定添加与T互补的 寡聚A。
四、目的基因导入受体细胞
取决于是否用合适的受体细胞、合适的 克隆载体和合适的基因转移方法
2、干热灭菌法
进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化， 微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起 中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死 亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受 力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温 度要高，时间要长，一般160～170℃， 1～1.5h。
使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅内 蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增高， 温度也随之增高，从而提高杀菌力，缩短 灭菌时间。
最有效而广泛应用的灭菌方法 实验室常用的是0.1MPa，121℃，
15～30min
应用范围
培养基，水，发酵罐等其他不适 合干热灭菌的物品。
高压蒸汽灭菌法的注意事项：
3.噬菌体载体 有λ噬菌体和M13噬菌体
三、基因与载体的连接
外源DNA与载体DNA之间连接方式：
1.粘性末端连接
先用一种酶切割外源DNA并将拟插入 的那个片段用凝胶电泳分离出来，再用 同一种酶去切载体DNA，这样可以通过 粘性末端连接起来。
2.平末端连接
3.在DNA片段末端加上均聚寡核苷酸后 连接：末端核苷酸转移酶能催化DNA末 端的3 ´-OH上添加单核苷酸的反应，形成 寡聚核苷酸连，如果在一个DNA片段的3
三、化学药品灭菌法
某些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、 酶失活、细胞通透性）而具有杀菌的作用。
化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操 作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。
化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的 不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸 等。
⑴ 高锰酸钾
高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨基 酸氧化，使微生物死亡，一般用0.1％～0.25 ％的溶液。
⑷ 新洁尔灭
新洁尔灭是表面活性剂类洁净消毒剂。它在水 溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌 体外膜损伤和蛋白变性。10 min能杀死营养细 胞，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。一般用 于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤剂 合用，不能接触铝制品。
⑸ 甲醛
甲醛(HCHO)是强还原剂，它能与蛋白质的 氨基结合，使蛋白质变性，对氨基和蛋白质的 变性有较强活性，这是用甲醛作为灭菌剂的根 据。使用时可以以2份37％甲醛溶液与1份 KMnO4混合，或者将37％甲醛溶液直接加热， 产生气态甲醛用于灭菌。甲醛灭菌的缺点是穿 透力差。
一、基因工程技术 通过对核酸分子的插入、拼
接和重组而实现遗传物质的重新组 合，借助载体将重组的目的基因转 移新的宿主细胞体系，并使目的基 因在新的宿主体系细胞中进行复制 扩增和表达所需的目的产物。
基因工程菌的制备
一、目的基因的制备 1.鸟枪法 选用合适的内切酶，在Mg2+的激活 下，切开供体DNA链获得目的基因，根 据酶切末端特点分为a、b两类。
蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是 目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条 件为121 ℃，30 min。
湿热灭菌法
煮沸灭菌法
将要消毒的物品放入水中煮沸（100℃）15～ 20min，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但 不能杀死芽孢。
巴氏消毒法
法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消毒 法。加热到62℃，经过30分钟，以杀死不耐高温 的物质中的微生物和病原体的消毒法。