美国USP鲎试剂检测方法

USP
这一章节的部分内容已与欧洲药典和日本药典协调一致，不一致的部分以符号*标出。

本章阐述了关于检查和定量供试品内毒素的方法。

本法利用鲎（Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus）血细胞提取物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（LAL）检定内毒素。

*1
该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。

检测时，可用其中任一种方法进行试验。

当测定结果可疑或有争议时，除非各论中另有规定，以凝胶法测定结果为准。

直接比较供试品溶液与标准内毒素溶液，判断凝胶法的反应终点。

内毒素含量以USP内毒素单位（USP-EU）表示。

[注-1USP EU相当于1个内毒素单位。

]
LAL试剂专用于浊度检查法或显色法，因此，使用这两种方法进行检定时，必须符合它们各自的要求。

两种检查法都要求建立标准曲线，以检定供试品的内毒素含量。

主要的实验步骤有：在预定的时间内将内毒素和对照品分别与LAL试剂保温培养；读取相应波长处的吸光度等。

使用终点浊度法时，应在孵育时间结束时马上读数；对终点显色法，则要在孵育终止时添加酶反应-终止制剂，反应停止后，方可读数。

动态浊度法和动态显色法分析整个反应时间内吸光度的变化，并通过这些读数计算比值。

仪器
所有玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。

*2去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。

若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。

[注-本章内，“管”也包括任何其他反应容器，如微孔板的孔等。

]
内毒素储备标准溶液和内毒素标准溶液的制备
USP内毒素RS的效价规定为10000 USP内毒素单位（EU）/西林瓶。

用5mL BET检查用水溶解1西林瓶中盛放的RSE*2，在漩涡式搅拌机中溶解，用时为30分钟，在此过程中应不时搅拌；用得到的浓缩液制取系列稀释液。

如不打算马上制取稀释液，应将浓缩液放在冰箱中保存，保存时间不得超过14天。

从冰箱里取出浓缩液后，在使用之前，应用漩涡式搅拌机搅拌，搅拌时间不少于三分钟。

稀释液在进一步稀释之前，也需要混匀，搅拌时间不得少于30秒。

吸附会对稀释液的活性造成损失；因此，除非有可靠的数据能支持稀释液的保存，否则都不应该保留稀释液。

预备实验
使用灵敏度经复核的LAL试剂。

为保证内毒素检查法的效力，需要证明供试品溶液、洗液、或供试品的提取物对检查反应没有阻抑或增强作用，也不会给试验带来干扰。

验证时，应对列出的三种方法分别进行阻抑或加强试验，阴性对照品也是验证的对象。

当LAL试剂的来源、生产商的方法或试验用物品的配方发生变化时，需要重新开展验证。

供试品溶液的制备
制备供试品溶液时，应以LAL试剂用水溶解或稀释药品，或润洗供试药品的容器。

也可能有其它的水溶液对某些物质或制剂的溶解、稀释或润洗能起到更好的效果。

如有必要，调节供试品溶液（或它的稀释液）的pH值，使LAL试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选LAL试剂的生产商建议的pH范围内。

一般要求供试品溶液的pH值范围为6.0——8.0。

可使用酸、碱或LAL试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲溶液调节pH值。

酸或碱溶液须用LAL试剂用水再已去除内毒素的容器中配置。

缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

确定最大有效稀释倍数
最大有效稀释倍数（MVD）指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。

这个概念对注
射剂或需要复溶、稀释的非肠胃给药的溶液及某些给药剂量会因给药体积的变化导致药品用量变化的药品也适用。

通常情况下，MVD按下列公式确定：
MVD = 内毒素限值×供试品溶液浓度/λ
供试品溶液的浓度和λ的有关规定如下：各论中给出了以体积（EU/mL）表示的内毒素浓度限值的定义。

用限度除以λ（λ为LAL试剂的标示灵敏度，单位EU/mL），即得MVD。

各论中，内毒素限值的单位是重量或有效成分的效价单位（EU/mL或EU/Unit），用它乘上供试品或按照标签说明复水的药品溶液的浓度（mg/mL或Unit/Ml）（两种做法均可行），得到的结果除以λ，得到的结果就是MVD因子。

MVD是试验有效时，供试品可被稀释的最大倍数。

确定内毒素限值
根据剂量，注射剂的内毒素限度等于K/M的值*3，其中K为人每公斤体重可接受的内毒素中热原的限值（EU/kg），M指人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。

各论中，注射药品的内毒素限值以EU/mL、EU/mg、EU/生物活性单位表示。

凝胶法
凝胶法系通过LAL试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或定量内毒素的方法。

标准条件下，能使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为LAL试剂的标示灵敏度。

为确保试验结果精确、有效，应根据凝胶法的预备试验中的说明展开试验，复核鲎试剂的标示灵敏度和试验的干扰因素。

凝胶法的预备试验
LAL试剂的标示灵敏度复核试验——试验时，取LAL试剂批中至少一支西林瓶。

用LAL试剂用水对倍稀释USP内毒素RS，得到2λ、λ、0.5λ和0.25λ四种浓度的稀释液（λ的定义见上文）。

每一个标准内毒素浓度和阴性对照品平行作4管。

当使用新批号的LAL试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行LAL试剂灵敏度复核试验。

在每支试管中，分别混合等体积（如0.1mL)的LAL试剂和标准溶液。

如使用的是装有LAL试剂冻干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接加入溶液。

按照LAL生产厂家的说明，保温装有反应试剂混合物的试管（通常在37±1℃下保存60±2分钟），在此过程中，不能震动试管。

保温结束后，为测试凝胶的完整性，缓缓将每个容器倒转1800。

如果形成了坚实的凝胶，倒转后凝胶不移位，此时将该项检查的结果记录为阳性。

如未能形成凝胶，或形成的凝胶不坚实、在倒转过程中出现了滑脱，该项检查的结果即为阴性。

仅在最低浓度的标准溶液的所有平行管的检查结果均为阴性的情况下，方可判定试验有效。

反应终点浓度指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

使用下面的公式，计算终点浓度的几何平均值：
终点浓度的几何平均值＝lg-1(Σe/f)
Σe为所用系列溶液的终点浓度的对数值的和；f为平行管的数量。

反应终点的几何平均值即为LAL试剂的标示灵敏度（单位为EU/mL）。

当终点浓度的几何平均值在0.5λ至2.0λ之间，可判定受试LAL试剂的标示灵敏度为λ。

凝胶法的干扰因素试验——按表1制备溶液A、B、C、D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过MVD的溶液，按LAL试剂灵敏度复核试验项下操作。

用检查法给出的公式计算溶液B、C 的反应终点的几何平均值。

表1 凝胶法的阻抑/增强试验溶液的制备
如试验条件发生了任何可能影响到试验结果的变化，须重新进行干扰因素试验。

只有当溶液A和D中无反应、且溶液C的结果在复核的标示灵敏度范围内时，试验方有效。

计算溶液B的鲎试剂灵敏度，如果值在[0.5λ，2.0λ]间，可判定供试品溶液在该浓度下无干扰作用；反之则判定供试品溶液对试验能形成干扰。

若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。

使用灵敏度更高的鲎试剂进行内毒素的检查时，因为灵敏度更高的鲎试剂能排除实验的干扰因素，供试品的稀释倍数也可适当放宽。

可通过对供试品溶液或进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。

为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会造成内毒素的活性损失，要使用预先添加了USP内毒素RS再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

凝胶法限度试验
各论有内毒素限度要求时，开展该项试验。

方法——按表2制备溶液A、B、C、D。

按凝胶法预备实验的LAL试剂标示灵敏度复核试验项下操作。

以该四种溶液为一组试验的供试品，每组试验做两组平行。

表2 凝胶限量试验溶液的制备
结果判断——只有阳性对照溶液B和C的平行管的试验结果均为阳性、阴性对照溶液D的平行管的试验结果均为阴性时，试验方有效。

溶液A的平行管的试验结果均为阴性时，可判定供试品符
合试验的内毒素限度要求。

若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，供试品不合格。

若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。

如复试中，溶液A的两个平行管均呈阴性，可将供试品判为符合内毒素限度要求。

若供试品溶液再小于MVD的稀释倍数下得到的试验结果为阳性，应将供试品溶液以更大的但不超过MVD的倍数进行稀释，再次开展试验。

凝胶定量试验
通过确定反应终点浓度，测定供试品的内毒素的含量。

操作步骤
按表3制备溶液A、B、C、D。

按凝胶法的预备试验项下的LAL试剂标示灵敏度复核试验项下的说明操作。

表3 凝胶定量试验溶液的制备
计算和结果判断——符合下列三个条件时，可将试验判为有效：（1）阴性对照溶液D的两组平行管均显阴性，（2）供试品阳性对照溶液B的两个平行管均显阳性，（3）溶液C的终点浓度的几何平均值在0.5λ—2λ之间。

系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度。

所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度（计算公式见凝胶法预备实验的LAL试剂标示灵敏度复核试验项）。

如果检验时采用的是供试品溶液的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时，要将结果乘以稀释倍数。

如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行定量试验的初始稀释倍数）。

如所有稀释液均呈阳性，应记为内毒素浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ（如表2中的初始稀释倍数乘以8λ）。

若内毒素浓度小于各论中规定的限值，判供试品符合规定。

光度测定法
浊度法系测量浊度的增加。

根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。

终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度及其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在的定量关系来测定内毒素含量的方法。

动态浊度法是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

显色法系利用检测LAL试剂与内毒素反应使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素的含量的方法。

这种方法也可分为终点显色法和动态显色法。

终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的定量关系来测定内毒素含量的方法。

动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预定吸光度（或透光率）所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。

根据LAL试剂生产厂家的建议，光度测定试验的试验温度一般为37±1℃。

光度测定法的预备试验
为确保浊度法和显色法试验结果精确、有效，应根据下面的说明，预先进行标准曲线的可靠性和干扰因素试验。

如试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，必须重新进行验证。

标准曲线的可靠性试验——用内毒素标准溶液，制成至少三个浓度的稀释液，以获取标准曲线。

根据LAL试剂生产厂家的说明（体积比、孵育时间、温度、pH等），每种标准内毒素浓度至少做三支平行管。

如动态法的预期范围超过2个对数（two logs），为使标准曲线反映出每个对数增长（log increase），应相应增加标准品溶液。

根据LAL试剂生产厂家的要求，相关系数的绝对值︱r︱必须大于等于0.980。

干扰因素试验——选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。

按表4制备溶液A、B、C、D，每种溶液至少做两组平行。

遵照LAL试剂生产厂家的说明（供试品和LAL试剂体积、供试品与LAL 试剂的体积比、孵育时间等），对这些溶液开展试验。

表4 光度测定法干扰试验溶液的制备
的平均回收率。

当内毒素的回收率在50％－200％之间时，可认为在此试验条件下供试品溶液中不存在干扰因素。

当内毒素的回收率不在指定范围内，应根据“凝胶法预备实验的干扰因素实验”项下的说明排除干扰因素。

重复干扰因素实验以验证处理的有效性。

光度测定法的操作步骤
按“凝胶法预备实验的干扰因素实验”项操作。

光度测定法的结果计算
用C系列阳性对照品得到的标准曲线，计算溶液A的所有平行管的内毒素含量。

只有在符合下列
两种情况时，试验方有效。

（1）对照品系列溶液C的结果符合“光度测定法预备实验的标准曲线可靠性试验”的要求；（2）用溶液B中的内毒素浓度减去溶液中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率应在50%-200%的范围内；（3）阴性对照品系列溶液D的试验结果不超过LAL试剂说明书中关于空白值限度的要求。

光度测定法的结果判断
使用光度测定法时，若校准了稀释度和浓度之后，溶液A的所有平行管的平均内毒素浓度小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。

1除内毒素之外，LAL试剂也与β-葡聚糖反应。

检定含β-葡聚糖的供试品时，必须使用不与β-葡聚糖反应的LAL试剂。

1钝化内毒素的方法见药典的“灭菌和无菌保证（1211）”章。

试验时，选用灵敏度不低于0.15内毒素单位/mL的LAL试剂。

1除鞘内注射给药（K为0.2 USP-EU/kg 体重）外，其他给药途径的制剂的K值均为5 USP-EU/kg。

非鞘内注射给药的放射性药品的内毒素限度由175/V计算而来，其中V是最大推荐剂量，单位为mL。

鞘内注射给药的放射性药品的内毒素限度的计算公式是14/V。

对体表给药的制剂（通常指抗癌剂）而言，每平方米体表面积的计算公式为K/M，其中K= 5 EU/kg，M（最大剂量/m/小时×1.80 m）取70kg。

1除内毒素之外，LAL试剂也与β-葡聚糖反应。

检定含β-葡聚糖的供试品时，必须使用不与β-葡聚糖反应的LAL试剂。

2钝化内毒素的方法见药典的“灭菌和无菌保证（1211）”章。

试验时，选用灵敏度不低于0.15内毒素单位/mL的LAL试剂。

3除鞘内注射给药（K为0.2 USP-EU/kg 体重）外，其他给药途径的制剂的K值均为5 USP-EU/kg。

非鞘内注射给药的放射性药品的内毒素限度由175/V计算而来，其中V是最大推荐剂量，单位为mL。

鞘内注射给药的放射性药品的内毒素限度的计算公式是14/V。

对体表给药的制剂（通常指抗癌剂）而言，每平方米体表面积的计算公式为K/M，其中K= 5 EU/kg，M（最大剂量/m/小时×1.80 m）取70kg。