瘤胃原虫

内蒙古农业大学博士学位论文31

①取低速离心（4000 转/分）的瘤胃液4ml 加入偏磷酸与甲酸按3：1

配置的混合液1ml，混匀，静置半小时以上，取离心管，内加入 2 克酸性吸

附剂（无水硫酸钠：50%硫酸：硅藻土=30：1：20）和4ml 的31.25mM 的巴

豆酸溶液，再加入上述混合瘤胃液1ml 摇匀，澄清，用1μl 的微量进样器

取样品上机进行测定。

②上机条件：仪器为日本岛津GC-7A 气相色谱仪。色谱柱为内径3mm

长2m 的不锈钢柱，担体为10%FFAP 加1%磷酸的ChromosorbW 担体，柱温105 ℃，汽化室温度200℃，离子化室温度230℃，氮气流速为1.75kg/cm

2

，氢

气压力为0.7kg/cm

2

,空气的压力为0.35 kg/cm

2

,灵敏度为10，衰减128。

1.6.5 原虫的计数

采集的瘤胃液立刻用两层纱布过滤，取滤液1ml 加4ml MFS 染液（甲基

绿福尔马林溶液）固定，静置30 分钟进行染色，然后用吸管（管口大于 1.0mm）

将混匀的样品稀释液以连续不断的液流充满血球计数室，盖上盖玻片，在光

学显微镜下进行镜检（100 倍）。每个样品计数10 个大方格，上下各 5 个大

方格，即四角4 个大方格和中央1 个大方格，其中四角每个大方格包含16

个中方格，中央1 个大方格包括20 个小方格（可以折算成16 个中方格，因

为16 个中方格的体积等于20 个小方格的体积），最后取平均数。按下列公

式计算纤毛虫数。

纤毛虫数/ml 16101000

= 16 N×10×××D×

= N×D×1000

N：所有方格中纤毛虫的总数

D：稀释倍数

16：每个大方格中有16 个中方格

10：共计数10 个大方格

1000：1mm

3

换算为1ml 时的倍数

MFS 溶液配方：将NaCl 8 克，甲基绿0.6 克，福尔马林溶液100ml 混合

定容至1000ml 即可。

1.6.6 真菌计数用培养基成分及制作

真菌计数所用培养基为液体培养基，由基础培养基、缓冲液A 和B、无78瘤胃厌氧真菌在纤维降解中的作用及其与细菌、原虫的关系

体内研究也表明驱除原虫后，降低了植物细胞壁的降解（Coleman,1885 ；Imai 和Ogimoto,1978 ；Willians,1982），究其原因，一方面是由于驱除原虫后，除掉了具有纤维水解活性的原虫，另一方面，直接或间接地去掉了纤维分解菌，因为原虫可吞噬细菌，包括纤维分解菌，而吞噬后的细菌可与原虫进行共生，这二个方面的原因导

致驱原虫后纤维物质降解率显著下降。然而也有相反的结果出现，在体内研究中，Romalo （1989）发现全部驱除原虫后，绵羊体内麦秸的消化率增加，瘤胃内消化率也升高；同样的结果由Preston 和Leng（1988）以及Ushida 等（1989）证实，对此现象的解释，他们认为可能是由于，纤维水解活性较高的细菌和真菌代替了纤维水解活性较低的原虫，或者可能是由于原虫吞噬功能消除引起的。本研究表明，驱除原虫后，真菌数量下降，细菌总数呈上升趋势，所以可排除后者的解释原因。

3 小结

本试验运用硫酸铜和十二烷基硫酸钠结合使用来驱除培养液内的原虫，

研究结果表明：

3.1 全部驱除培养液中的原虫的最佳浓度为硫酸铜0.15mg/ml，十二烷

基硫酸钠0.01mg/ml，在以后的试验中全部驱除原虫皆用此浓度；

3.2 全部驱除原虫后，培养液中厌氧真菌的总数显著下降，下降幅度达

50%左右，可能原虫和真菌间存在着协同作用；

3.3 全部驱除原虫后，培养液中厌氧细菌的总数呈上升趋势，说明瘤胃

原虫和细菌之间有较强的竞争作用；

3.4 用硫酸铜和十二烷基硫酸钠驱除瘤胃液内的原虫时，随着驱原虫剂

浓度的增加，稻草72 h DM 降解率逐渐下降，最佳浓度组降低幅度达56.37%，

说明原虫在稻草DM 降解中发挥了重要的作用。由表2-11 和图2-5 可以看出，驱除原虫后培养液内平均细菌总数差异不显著（P>0.05），但从不同时间点来看，接种后0-4h 驱原虫组细菌总数低于对照组，而从6h 开始到72h 培养结束，驱原虫组的细菌总数均高于对照组，这说明瘤胃内原虫和细菌之间有强烈的竞争作用，当原虫被驱除后，细菌总数则显著增加，而0-4h 的总数低于对照组则可能是由于驱原虫剂的加入使培养液中的动态平衡遭到破坏而出现的短期下降。这一结果与不少学者得到的研究结果相一致（Coleman，1989；Bonhomme，1990；Williams andColeman，1992），目前普遍认为细菌细胞被原虫选择性地吞食进入液泡胞质并在此进行消化（Coleman,1989 ；Bonhomme,1990;Williams 和Coleman,1992），原虫的吞食活性可影响细菌不同品种的构成和总的细菌数量（Arakaki 等,1994）。

64 日粮内不同粗饲料品质对绵羊瘤胃发酵功能和微生物区系的影响

致谢

本论文得到了导师孙海洲老师、卢德勋先生和高民博士的精心指导。感谢恩师孙海洲老师和卢德勋研究员在生活上和学习上给予的关爱和教诲；感谢高民博士为试验的顺利进行在多方面给予了大力的帮助。感谢师母冯允义女士所给予的慈母般的呵护和关怀。论文付梓之时，祝福三位恩师合家欢乐，一生平安。感谢内蒙古畜牧科学院动物营养所的各位老师，特别是张春华为本试验付出了辛勤的汗水。感谢内蒙古农业大学的赵志恭教授、侯先志教授、敖长金教授、闫素梅教授、金曙光教授、噶尔迪教授、敖日格乐、吐日根教授在试验的设计和方法上给予的很多帮助。感谢实验室一起求学的同学在试验中给予的诸多帮助和在生活上的关心。我会永远记住与你们一起度过的日子！

特别感谢薛丰和郭圆在分子生物学试验部分的全力帮助；感谢论文撰写过程中孙满吉、胡红莲、郭雪锋、孙献忠和刘兵等的倾心帮助。感谢我的家人和侯志军先生在学习和生活上给予诸多的支持与关怀，是他们的关心和支持成就了我学业上的进步。

最后感谢所有在实验中给予帮助的老师、同学和朋友，愿他（她）们生活幸福，万事如意。

内蒙古农业大学硕士学位论文65

参考文献