携带融合基因重组腺相关病毒载体的构建_何娟娟

网络出版时间：2012-04-28 15:36
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携带NT4-AcSDKP融合基因重组腺相关病毒载体的构建
何娟娟1，马列婷2，王亚文2，惠凌云2，杨广笑3，王全颖3
（1.西安交通大学医学院临床检验诊断专业，陕西西安710061；
2.西安交通大学第一医院检验科，陕西西安710061；
3.西安华广生物工程有限公司，陕西西安710025）
摘要：目的构建携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒，为探讨
AcSDKP（乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸）的多样化功能提供基础。

方法以质粒载体pGEM-T Easy/NT4为模板，PCR技术获得NT4-AcSDKP基因
片段，插入腺相关病毒载体穿梭质粒PSSHG-CMV，构建重组质粒
pSSCMV-NT4-AcSDKP。

用腺病毒全基因组质粒pFG140、辅助质粒pAAV/Ad
和已构建的重组质粒，三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞，包装
rAAV-NT4-AcSDKP，RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。

结果成功合成
NT4-AcSDKP基因，构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP，包装获得滴度为3.40
×1010copies/ml的重组腺相关病毒。

结论成功获得表达AcSDKP重组腺相关
病毒，为抗炎、抗纤维化、器官修复等方面的进一步研究奠定了基础。

关键词：NT4-AcSDKP；PCR技术；重组腺相关病毒
中图分类号：文献标志码：A 文章编号：1671-8259
Construction of NT4-AcSDKP recombinant adeno-associated virus
HE Juan-juan1, MA Lie-ting2, WANG Ya-wen2, HUI Ling-yun2,
YANG Guang-xiao3, WANG Quan-ying3
(1. Specialty of Clinical Diagnosis, Medical School of Xi’an Jiaotong University,
Xi’an, 710061; 2. Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital,
Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 3. Xi’AN Huaguang
Biological Engineering Co. Ltd., Xi’ an, 710025, China)
ABSTRACT: Objective To construct and produce the NT4-AcSDKP recombinant
adeno-associated virus (AAV) and determinate the titer. Methods With plasmid
收稿日期：2011-12-15 修回日期：2012-03-10
通讯作者：马列婷，主任技师. E-mail: mltmed@
作者简介：何娟娟（1985-），女（汉族），硕士研究生. E-mail: he88531250@
vector pGEM-T Easy/NT4 as the template, NT4-AcSDK was obtained by polymerase chain reaction (PCR) and inserted into vector plasmid PSSHG-CMV to construct the recombinant plasmid pSSCMV-NT4-AcSDKP. The recombinant AAV-NT4-AcSDKP was packaged through co-transfecting 80% of confluent 293 cells with adenovirus full genome plasmid pFG140, helper plasmid pAAV/Ad and the recombinant plasmid. The recombinant AAV-NT4-AcSDKP was titrated by RT-PCR. Results The gene of NT4-AcSDKP was synthesized and the recombinant plasmid pSSCMV-NT4-AcSDKP was constructed successfully. RT-PCR results showed that we had obtained the rAAV of high titer (3.40×1010copies/ml). Conclusion We have successfully obtained the AcSDKP-expressing rAAV and paved the way for further studies on anti-inflammation, anti- fibrosis, and organ repair.
KEY WORDS: NT4-AcSDKP; polymerase chain reaction (PCR) technique; recombinant adeno-associated virus (rAAV)
近年来，由于AcSDKP（乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸）在人体内广泛存在且生物功能多样化引起科学工作者的广泛关注，经大量研究证实四肽AcSDKP可以抑制造血干/祖细胞增殖，对人骨髓间充质干细胞也有抑制作用，在放化疗期间起到保护剂的作用[1]；促进血管发生、抗炎症、促进生殖系统发育等，而且对肾脏[2]、心脏[2-3]、肝脏[4]、肺[5]等器官损伤引起的纤维化也具有抑制作用，因此其成为研究热点，对多种临床疾病治疗具有巨大潜力。

然而AcSDKP 获得途径受限，目前几乎都是商品化合成，价格昂贵，因此本文应用PCR技术、T-载体克隆法和病毒包装技术，构建并包装表达目的蛋白AcSDKP的重组腺相关病毒，为深入开展AcSDKP在治疗炎症、器官纤维化等疾病方面的研究奠定了基础。

1 材料与方法
1.1 材料质粒载体pGEM-T Easy/NT4，由张华博士构建赠送；克隆载体pGEM-T质粒购自Promega公司；限制性内切酶Eco RⅠ、Bam HⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等试剂购自华美生物工程公司；辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒全基因组质粒pFG140、腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV、293细胞系、
大肠杆菌TOP10、E. coli DH5α菌株及试验设备等均由西安华广生物工程公司提供。

1.2 目的基因NT4-AcSDKP的PCR扩增根据Genbank提供的MSDKP基因序列和已有的pGEM-T Easy/NT4载体模板，使用负链延伸原理，设计正、反向引物，正向引物加入保护碱基和Eco RⅠ酶切位点（G↓AA TTC），反向引物加入保护碱基、终止子和Bam HⅠ酶切位点（G↓GA TCC），并使负向引物中3′端有20个碱基与模板互补，应用DNASIS计算机软件设计下列引物，引物为BioAsia
94℃变性5min72℃再延伸
的基因TOP10
含Amp
酶Eco
1.3 质粒
合酶切
10g/L
基因片段，连接产物转化感受态细菌E.coli DH5α，碱裂解法小提质粒用Eco RⅠ和Bam HⅠ联合酶切，筛选出重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP，然后碱裂解法大量提取重组阳性质粒（图1）。

重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP构建过程示意图
1.4 、1.5 液中，
1.6
量60s，54℃
2 结果
2.1 cDNA克隆及鉴定以pGEM-T Easy/NT4载体为模板进行PCR，所得产物和DNA marker参照物相对比，琼脂糖凝胶电泳获得约270bp的NT4-AcSDKP 基因片段，该值与理论值相符(图2)。

构建的克隆载体质粒命名为pGEM-T /NT4-AcSDKP，大小约为3270bp。

经Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果可见约270bp的目的片段，与理论值相符，显示阳性重组质粒被完全切开，说明NT4-AcSDKP成功重组于pGEM-T内(图3)，并且在测序的回报结果中找到NT4-AcSDKP融合基因序列，应用DNASIS软件分析，显示测序结果与我们设
计的融合基因序列完全一致。

a b
270bp
图2 产物电泳图
Fig.2 Identification of PCR product of NT4-AcSDKP cDNA
a：PCR
a b c
图3 pGEM-T /NT4-AcSDKP酶切电泳鉴定
Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid
a
c：
2.2 ，转化感受态细菌E.coli DH5α菌株，提重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP，Eco R I和Bam HⅠ联合酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳，分别得到约为270bp与5202bp两基因片段，与理论值相符(图4)。

a b c
图4 pSSCMV-NT4-AcSDKP酶切鉴定电泳图谱
Fig.4 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pSSCMV-NT4-AcSDKP
a：重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP；b：重组质粒经E co RⅠ、B am HⅠ酶切；c：DNA Marker。

2.3 重组腺相关病毒的包装与滴度测定结果将成功构建的pSSCMV-NT4-AcSDKP、包装质粒pAAV/Ad和腺病毒全基因组质粒pFG140，采用三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞，包装得到重组腺相关病毒。

利用RT-PCR法测定滴度为
3.40×1010 copies/ml。

3 讨论
AcSDKP是胸腺素β4（Tβ4）的氨基端四肽，其氨基端含有POP（脯氨酰寡肽酶）裂解位点，经此酶裂解可获得四肽AcSDKP。

根据等电点的不同，胸腺素分为a、β、γ三类。

β族胸腺素等电点为5.0～7.0，其结构高度保守，由40～44个氨基酸组成，目前已发现的β族胸腺素有15种，其中Tβ4是在人体内分布最广泛、含量最多的，具有多种功能，如抗炎症[6]、修复损伤组织[7]等。

作为Tβ4的氨基端肽，AcSDKP具有同样的生物功能，如通过抑制造血干/祖细胞、骨髓间充质干细胞的增殖，在癌症病人治疗期间发挥保护骨髓造血功能的作用；促进血管发生、抗炎等，另外其对各种损伤因素引起肾脏[2]、心脏[2-3]、肝脏[4]的纤维化也具有抑制作用。

大量研究证实四肽具有多种功能，引起许多科学工作者的高度关注，但是AcSDKP存在半衰期短、生物利用率低、来源短缺、价格昂贵等缺点，限制了对其的实验研究，丧失了广泛的临床应用前景。

为解决AcSDKP的上述缺点，本实验利用基因工程技术，成功设计并包装
了可分泌表达AcSDKP的重组腺相关病毒。

作者创新性地将融合基因插入腺相关病毒载体中，构建重组腺相关病毒载体，进一步包装病毒。

重组腺相关病毒在体内可以建立一个小加工厂，可以持续分泌表达AcSDKP，这样就解决了四肽半衰期短、生物利用率低、来源短缺、价格昂贵、重复给药等缺点。

由于AcSDKP 为分泌蛋白，为使其表达之后可以顺利到达病变组织，在构建目的基因时还加入信号肽NT4，与AcSDKP基因融合。

NT4不但含有内肽酶裂解点，将目的蛋白分泌到细胞外发挥作用，而且可防止宿主细胞对目的蛋白的降解并恢复其天然构象。

基因工程载体有很多种，如腺病毒、脂质体等，但是腺病毒载体容易引发炎症或者毒性反应，免疫原性强，可能在机体内会被中和，而且其携带的外源目的基因不能长期、稳定表达[8]，脂质体也存在与腺病毒相同的缺陷。

然而腺相关病毒（AAV）是到目前为止发现的唯一一个无致病性的单链DNA病毒，也是唯一已知的能与人基因组特异染色体定点整合的天然复制缺陷病毒[9]。

它无明显的致病性，无免疫原性和炎症反应[10]；AAV以点特异方式固定的整合在人19号染色体；插入到AAV中的外源基因表达时间长等特点，因此使其被广泛用于基因治疗研究中。

表达AcSDKP的重组腺相关病毒的成功构建对其生物功能及作用机制的研究奠定了基础，减经了实验经费负担，最主要的是解决了四肽未来应用于临床的各种困难，减轻了病人经济负担。

重组病毒将来能否有效的用于临床病人，我们将进行大量动物实验，观察其是否在体内发挥与商品化的AcSDKP相同的生物功能，达到临床预防与治疗目的，使其广泛应用于临床成为可能，为多种疾病提供创新、安全、有效的治疗方式。

参考文献：
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（编辑国荣）。