银杏叶提取物对活化血小板刺激人冠状动脉内皮细胞产生ROS表达LOX-1和磷酸化p38MAPK的影响

银杏叶提取物对活化血小板刺激人冠状动脉内皮细胞产生ROS 以及表达LOX-1和磷酸化p38MAPK 的影响

朱贤关

李忠东

1

王建昌

2

孟如松

3

（安徽医科大学研究生学院，安徽合肥230000）

〔摘

要〕目的

研究银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract ，

EGb ）对活化血小板刺激人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells ，HCAECs ）产生ROS 和表达LOX-1、磷酸化p38MAPK 的影响。方法

将HCAECs 随机分为空白组，活化血小板组和活化血小板+银杏叶提取物

低、中、高剂量组（分别为4、40、400μg /ml ），应用H 2DCF-DA 探针、Western 印迹分别检测ROS 的产生以及LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达。结果活化血小板可以介导HCAECs 表达ROS 、

LOX-1和磷酸化p38MAPK （P ＜0.05）；EGb 能明显抑制ROS 的产生以及LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达（P ＜0.05），随着EGb 浓度增高，ROS 和LOX-1抑制效果越明显，磷酸化p38MAPK 现象不明显。结论EGb 对HCAECs 的保护机制可能与抑制

ROS 、LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达有关。

〔关键词〕银杏叶提取物；活化血小板；ROS ；LOX-1；磷酸化p38MAPK 〔中图分类号〕R28

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0546-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.047基金项目：首都医学发展科研基金（No.SF-2007-II-06）1空军总医院药学部2

空军总医院空军老年医学研究所

3

空军总医院中心实验室皮肤科

通讯作者：王建昌（1960-），男，教授，博士生导师，主要从事老年心血管

病研究。

第一作者：朱贤关（1985-），男，在读硕士，主要从事老年心血管病研究。

动脉粥样硬化（atherosclerosis ，

AS ）的发病机制有多种学说，如损伤反应学说、AS 氧化学说（oxidative hypothesis ）等，实验证明，他汀类、阿司匹林、维生素E 和C 等和某些中药通过抗氧化作用，

阻断AS 的发展。银杏叶提取物（EGb ）是天然中草药银杏叶的提取物，主要成分有黄酮类、萜类、原花色素类以及其他未知成分

〔1〕

。研究证明，该药治疗心脑血管疾病作用机制

主要是抑制体内自由基〔2〕

和血小板活化因子（platelet activating factor ，PAF ）的产生

〔3〕

。本文观察活化血小板与内皮细胞上的脂氧合酶同工酶（LOX-1）受体结合后对自由基产生的影响，并分析丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK ）磷酸化通路产生炎症因子的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1

细胞

人冠状动脉内皮细胞（human coronary endotheli-

al cells ，HCAECs ）。购自ScienCell TM 实验室（ScienCell TM Re-search Laboratories ）；血小板，健康成年志愿者，抽血前2w 内未吸烟，未服用任何抗血小板药物。1.1.2

药物、试剂及仪器

EGb （中国药品生物制品检定所）；

二氯二氢荧光素二乙酯（2'，

7'-dichlorodihydrofluorescein diace-tate ，H 2DCF-DA ）探针（Invitrogen 公司），小鼠抗人LOX-1单抗（R＆D systems 公司），小鼠抗人p-p38MAPK 单抗（Santa Cruz 公司），小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin ）抗体，辣根过氧化物酶（HRP ）标记山羊抗小鼠抗体（中杉金桥）。离心机，荧光显微镜，温箱。1.2方法

1.2.1

活化血小板制备

健康成年志愿者，抽血前2w 内未

吸烟，未服用任何抗血小板药物。未扎止血带抽取新鲜静脉血20ml ，注入含有3.8%枸橼酸钠（1ʒ9）抗凝溶液的聚丙乙烯试管内，上下颠倒轻摇充分混匀；立即室温下1200r /min 离心5min ，收集富集血小板血浆（platelet-rich plasma ，PRP ）；PRP 室温下3000r /min 离心15min ，沉淀血小板用台式缓冲液洗涤2

次，并复悬于台式缓冲液，调整血小板计数为2ˑ108/ml 〔1〕

。加

入终浓度为5μmol /L 的ADP ，轻摇充分混匀20min ，即为活化血小板，备用。1.2.2

分组

HCAECs 培养参照以前实验〔4〕

，将第5 7代

HCAECs 随机分为空白组、活化血小板组、活化血小板+EGb 低剂量组（4μg /ml ）、活化血小板+EGb 中剂量组（40μg /ml ）、活化血小板+EGb 高剂量组（400μg /ml ）。活化血小板（2ˑ108/ml ）与内皮细胞在37ħ温箱孵育12h 后，加入药物EGb ，再孵育12h 。1.2.3

H 2DCF-DA 探针检测活性氧（ROS ）的表达

加入药物

再孵育12h 后，每组加入终浓度为2μmol /L 的H 2DCF-DA 探针，继续孵育30min ，快速在荧光显微镜下观察并采集图像。用CMIAS 医学图像分析系统（北京航空航天大学研发）分析采集图像，以平均光密度（视觉平均颜色的深度）表示荧光强度。1.2.4

Western 印迹检测LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达

取孵育完成的内皮细胞，除去培养基并用磷酸盐缓冲液（PBS ）洗涤3次，胰酶消化收集细胞，加复苏促进因子结合蛋白A （RIPA ）裂解液，在冰上裂解，提取蛋白质后二喹啉甲酸（BCA ）法进行蛋白浓度测定。加上样缓冲液，

100ħ变性10min ，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）电泳分离蛋白，再通过转膜将蛋白转到0.45μm 聚偏氟乙烯（PVDF ）膜上，用

Tris 盐酸盐缓冲液（TBST ）配制的5%脱脂奶粉封闭1h ，分别加入一抗（LOX-1，1ʒ200；p-p38MAPK ，1ʒ300；β-actin ，1ʒ2000），4ħ过夜，TBST 洗膜，5min 3次，加HRP 标记二抗（1ʒ10000），室温孵育1h ，TBST 洗膜，5min 3次，加ECL 显影液，曝光。Quantity One 软件分析处理扫描图像。1.3

统计学方法

应用SPSS13.0统计软件，数据资料以x ʃs

表示，采用单因素方差分析，多样本间均数比较采用完全随机方差分析SNK-

q 检验。