银杏叶提取物对活化血小板刺激人冠状动脉内皮细胞产生ROS表达LOX-1和磷酸化p38MAPK的影响

银杏叶提取物对活化血小板刺激人冠状动脉内皮细胞产生ROS 以及表达LOX-1和磷酸化p38MAPK 的影响
朱贤关
李忠东
1
王建昌
2
孟如松
3
（安徽医科大学研究生学院，安徽合肥230000）
〔摘
要〕目的
研究银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract ，
EGb ）对活化血小板刺激人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells ，HCAECs ）产生ROS 和表达LOX-1、磷酸化p38MAPK 的影响。

方法
将HCAECs 随机分为空白组，活化血小板组和活化血小板+银杏叶提取物
低、中、高剂量组（分别为4、40、400μg /ml ），应用H 2DCF-DA 探针、Western 印迹分别检测ROS 的产生以及LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达。

结果活化血小板可以介导HCAECs 表达ROS 、
LOX-1和磷酸化p38MAPK （P ＜0.05）；EGb 能明显抑制ROS 的产生以及LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达（P ＜0.05），随着EGb 浓度增高，ROS 和LOX-1抑制效果越明显，磷酸化p38MAPK 现象不明显。

结论EGb 对HCAECs 的保护机制可能与抑制
ROS 、LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达有关。

〔关键词〕银杏叶提取物；活化血小板；ROS ；LOX-1；磷酸化p38MAPK 〔中图分类号〕R28
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0546-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.047基金项目：首都医学发展科研基金（No.SF-2007-II-06）1空军总医院药学部2
空军总医院空军老年医学研究所
3
空军总医院中心实验室皮肤科
通讯作者：王建昌（1960-），男，教授，博士生导师，主要从事老年心血管
病研究。

第一作者：朱贤关（1985-），男，在读硕士，主要从事老年心血管病研究。

动脉粥样硬化（atherosclerosis ，
AS ）的发病机制有多种学说，如损伤反应学说、AS 氧化学说（oxidative hypothesis ）等，实验证明，他汀类、阿司匹林、维生素E 和C 等和某些中药通过抗氧化作用，
阻断AS 的发展。

银杏叶提取物（EGb ）是天然中草药银杏叶的提取物，主要成分有黄酮类、萜类、原花色素类以及其他未知成分
〔1〕。

研究证明，该药治疗心脑血管疾病作用机制
主要是抑制体内自由基〔2〕
和血小板活化因子（platelet activating factor ，PAF ）的产生
〔3〕。

本文观察活化血小板与内皮细胞上的脂氧合酶同工酶（LOX-1）受体结合后对自由基产生的影响，并分析丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK ）磷酸化通路产生炎症因子的影响。

1材料与方法1.1材料1.1.1
细胞
人冠状动脉内皮细胞（human coronary endotheli-
al cells ，HCAECs ）。

购自ScienCell TM 实验室（ScienCell TM Re-search Laboratories ）；血小板，健康成年志愿者，抽血前2w 内未吸烟，未服用任何抗血小板药物。

1.1.2
药物、试剂及仪器
EGb （中国药品生物制品检定所）；
二氯二氢荧光素二乙酯（2'，
7'-dichlorodihydrofluorescein diace-tate ，H 2DCF-DA ）探针（Invitrogen 公司），小鼠抗人LOX-1单抗（R＆D systems 公司），小鼠抗人p-p38MAPK 单抗（Santa Cruz 公司），小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin ）抗体，辣根过氧化物酶（HRP ）标记山羊抗小鼠抗体（中杉金桥）。

离心机，荧光显微镜，温箱。

1.2方法
1.2.1
活化血小板制备
健康成年志愿者，抽血前2w 内未
吸烟，未服用任何抗血小板药物。

未扎止血带抽取新鲜静脉血20ml ，注入含有3.8%枸橼酸钠（1ʒ9）抗凝溶液的聚丙乙烯试管内，上下颠倒轻摇充分混匀；立即室温下1200r /min 离心5min ，收集富集血小板血浆（platelet-rich plasma ，PRP ）；PRP 室温下3000r /min 离心15min ，沉淀血小板用台式缓冲液洗涤2
次，并复悬于台式缓冲液，调整血小板计数为2ˑ108/ml 〔1〕。

加
入终浓度为5μmol /L 的ADP ，轻摇充分混匀20min ，即为活化血小板，备用。

1.2.2
分组
HCAECs 培养参照以前实验〔4〕
，将第5 7代
HCAECs 随机分为空白组、活化血小板组、活化血小板+EGb 低剂量组（4μg /ml ）、活化血小板+EGb 中剂量组（40μg /ml ）、活化血小板+EGb 高剂量组（400μg /ml ）。

活化血小板（2ˑ108/ml ）与内皮细胞在37ħ温箱孵育12h 后，加入药物EGb ，再孵育12h 。

1.2.3
H 2DCF-DA 探针检测活性氧（ROS ）的表达
加入药物
再孵育12h 后，每组加入终浓度为2μmol /L 的H 2DCF-DA 探针，继续孵育30min ，快速在荧光显微镜下观察并采集图像。

用CMIAS 医学图像分析系统（北京航空航天大学研发）分析采集图像，以平均光密度（视觉平均颜色的深度）表示荧光强度。

1.2.4
Western 印迹检测LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达
取孵育完成的内皮细胞，除去培养基并用磷酸盐缓冲液（PBS ）洗涤3次，胰酶消化收集细胞，加复苏促进因子结合蛋白A （RIPA ）裂解液，在冰上裂解，提取蛋白质后二喹啉甲酸（BCA ）法进行蛋白浓度测定。

加上样缓冲液，
100ħ变性10min ，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）电泳分离蛋白，再通过转膜将蛋白转到0.45μm 聚偏氟乙烯（PVDF ）膜上，用
Tris 盐酸盐缓冲液（TBST ）配制的5%脱脂奶粉封闭1h ，分别加入一抗（LOX-1，1ʒ200；p-p38MAPK ，1ʒ300；β-actin ，1ʒ2000），4ħ过夜，TBST 洗膜，5min 3次，加HRP 标记二抗（1ʒ10000），室温孵育1h ，TBST 洗膜，5min 3次，加ECL 显影液，曝光。

Quantity One 软件分析处理扫描图像。

1.3
统计学方法
应用SPSS13.0统计软件，数据资料以x ʃs
表示，采用单因素方差分析，多样本间均数比较采用完全随机方差分析SNK-
q 检验。

2结果
2.1
活化血小板诱导ROS 、
LOX-1和磷酸化p38MAPK （p-p38MAPK ）表达活化血小板与HCAECs 孵育之后，可显著
诱导ROS 产生，显著诱导LOX-
1和p-p38MAPK 表达（P ＜0.05）。

见图1。

2.2EGb 抑制ROS 产生低、中、高剂量组平均光密度分别
为0.89ʃ0.27，0.53ʃ0.07，0.42ʃ0.16；空白组、活化血小板组平均光密度分别为0.29ʃ0.04、
0.97ʃ0.24。

可见不同浓度的EGb 对ROS 的产生均有明显的抑制作用（P ＜0.05），且具有剂量依赖性。

图1。

图1
荧光显微镜下各组ROS 表达水平
2.3
EGb 抑制LOX-1表达
不同浓度的EGb 对LOX-
1的表达均有明显的抑制作用（P ＜0.05），且具有剂量依赖性。

见表1，图2。

2.4
EGb 抑制p-p38MAPK 表达
EGb 对p-p38MAPK 有显著
抑制作用（P ＜0.05），但EGb 不同浓度对p-p38MAPK 的表达抑制作用无显著性差异。

见表1，
图2。

1：空白组；2：活化血小板组；3：活化血小板+EGb 低剂量组；4：活化血小板+EGb 中剂量组；5：活化血小板+EGb 高剂量组
图2LOX-1和p-p38MAPK Western 印迹结果表1
各组LOX-1和p-p38MAPK 表达比较（n =3）组别
LOX-1/β-actin p-p38MAPK /β-actin 空白组
0.132ʃ0.0190.600ʃ0.004活化血小板组
0.344ʃ0.0481）0.851ʃ0.0141）活化血小板+EGb 低剂量组
0.159ʃ0.0142）
0.586ʃ0.0231）2）
活化血小板+EGb 中剂量组0.094ʃ0.0222）3）
0.580ʃ0.027
1）2）
活化血小板+EGb 高剂量组0.046ʃ0.0031）2）3）4）
0.571ʃ0.0271）2）与空白组比较：1）P ＜0.05；与活化血小板组比较：2）P ＜0.05；与活化血小板+EGb 低剂量组比较：3）P ＜0.05；与活化血小板+EGb 中剂量组比较：4）P ＜0.05
3讨论
目前证实，活化血小板主要与内皮细胞LOX-1结合，通过
一定通路介导内皮细胞表达大量ROS
〔3，4〕
，导致内皮细胞功能障碍，进而导致AS 。

本实验证实，活化血小板与内皮细胞结合12h 后，再加入EGb 作用12h ，可使内皮细胞产生的ROS 明显下降，且具有剂量依赖性，提示EGb 可能阻断活化血小板与内皮细胞LOX-1结合后的信号转导通路。

内皮细胞上LOX-1有多种配体，如ox-LDL 、同型半胱氨酸、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和活化血小板等，这些配体与LOX-1结合后，可通过相同或不同的信号通道如p38MAPK 、p44/42-MAPK 、蛋白激酶C （PKC ）、蛋白激酶B （PKB ）、酪氨酸激酶
（PTK ）等激活还原型辅酶Ⅱ（NADPH ）氧化酶〔5〕
等氧化酶产生大量ROS 和核转录因子（NF-
κB ）〔6〕
表达，以及导致内皮细胞功能失调
〔7〕。

何艳〔8〕
等报道，银杏黄酮苷元对ox-LDL 诱导的人脐静脉内皮细胞LOX-1表达具有抑制作用；梁燕玲〔9〕
等研究证
实，银杏叶提取物对同型半胱氨酸诱导LOX-1mRNA 的表达具有抑制作用；徐西振
〔10〕
等发现EGb 抑制TNF-α诱导的牛主动
脉内皮细胞LOX-1的表达。

本实验发现，活化血小板与内皮细胞结合12h 后，
加入EGb 作用12h ，也可使内皮细胞上LOX-1表达量下降，且具有剂量依赖性，提示EGb 可以阻断不同配体与LOX-1结合后的信号通路。

在上述信号通道中，
MAPK 介导的信号转导通路是生物信号引起核反应的重要通路，
在细胞生长、增殖、分化及凋亡的调节中起到至关重要的作用。

MAPK 家族主要有细胞外信号调节激酶（EKR1/ERK2）、应激活化蛋白激酶（JNK /SAPK ）和p38MAPK ，其中p38MAPK 通路是参与内皮细胞炎症反应的细胞内的重要通路，在致炎因子与LOX-1结合后，p38MAPK 由非磷酸化转化为磷酸化状态，促进下游底物的磷酸化，启动核因
子，促进炎性介质分泌，介导炎症反应，参与AS 形成〔11〕。

本实
验证实活化血小板与内皮细胞结合12h 后，
再加入EGb 作用12h ，EGb 可以抑制磷酸化的p38MAPK 表达，提示活化血小板与内皮细胞结合后的信号通路可能是p38MAPK 通路，阻断p38MAPK 的磷酸化，阻断AS 的发展。

总之，
EGb 可通过阻断活化血小板与LOX-1结合后的信号转导通路发挥作用，p38MAPK 通路可能是其主要通路，阻断p38MAPK 的磷酸化，阻断AS 的发展。

·
745·朱贤关等银杏叶提取物对活化血小板刺激人冠状动脉内皮细胞产生ROS 以及表达LOX-1和磷酸化p38MAPK 的影响第3期
4
参考文献
1Singh B ，Kaur P ，Gopichand M ，et al .Biology and chemistry of ginkgo bi-loba 〔J 〕.Fitoterapia ，2008；79（16）：401-18.
2
Mansour SM ，Bahgat AK ，El-Khatib AS ，et al .Ginkgo biloba extract （EGB 761）normalizes hypertension in 2K ，1C hypertensive rats ：role of antioxi-dant mechanisms ，ACE inhibiting activity and improvement of endothelial dysfunction 〔J 〕.Phytomedicine ，2011；18（8-9）：641-7.
3Koch E.Inhibition of platelet activating factor （PAF ）-induced aggregation of human thrombocytes by ginkgolides ：Considerations on possible bleed-ing complications after oral intake of ginkgo biloba extracts 〔J 〕.Phyto-medicine ，2005；12（1-2）：10-6.
4Chen JW ，Zhou SB ，Tan ZM.Aspirin and pravastatin reduce lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1expression ，adhesion molecules and oxidative stress in human coronary artery endothelial cells 〔J 〕.Chin Med J （Engl ），2010；123（12）：1553-6.
5张婧，王建昌，黄秀清，等.外周血单个核细胞NADPH 氧化酶活
性及表达与颈动脉硬化的关系研究〔J 〕.中国老年学杂志，2008；28（2）146-9.6
陈
花，王建昌，孟如松，等.血管黏附蛋白-1、核因子-κB 在动脉粥
样硬化斑块中的表达及其意义〔J 〕.中国老年学杂志，2007；27（14）：1342-4.7
Navarra T ，Del Turco S ，Berti S ，et al .The lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1and its soluble form ：cardiovascular implications 〔J 〕.J Atheroscler Thromb ，2010；17（4）：317-31.8
何
艳，付永昕，吴立荣，等.银杏黄酮苷元对ox-ldl 诱导的人脐静脉内皮细胞p-选择素、lox-1表达的影响〔J 〕.新医学，2009；40（10）：647-50.9梁燕玲，许治强，匡永锋，等.银杏叶提取物对同型半胱氨酸诱导lox-1mRNA 表达升高的拮抗作用〔J 〕.广东医学，2008；29（1）：53.10
徐西振，李
耕，冯文静，等.银杏叶提取物对TNF-α诱导的牛主
动脉内皮细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体表达的影响及其机制〔J 〕.中国病理生理杂志，2010；26（12）：2316-20.11
Wang WY ，Li J ，Yang D ，et al .Oxldl stimulates lipoprotein-associated phospholipase α2expression in THP-1monocytes via PI3K and p38MAPK pathways 〔J 〕.Cardiovasc Res ，2010；85（2）：845-52.
〔2011-07-10收稿2011-11-20修回〕
（编辑袁左鸣/徐杰）
PAR-2对心肌缺血再灌注损伤大鼠Bax 和Bcl-2mRNA 表达的影响
刘
阳
李莉（三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院心血管病研究所，湖北宜昌443001）
〔摘
要〕目的探讨蛋白酶激活受体2（PAR-2）对缺血再灌注（IR ）大鼠心肌Bax 和Bcl-2mRNA 表达的影响。

方法40只雄性SD 大鼠随机分为假手术组、
I /R 组和SLIGRL-NH 2（0.5，1，3mg ）组。

结扎左冠状动脉前降支30min ，再灌注120min 制作心肌I /R 模型；采用实时荧光定量PCR 法检测大鼠心肌组织Bcl-2和Bax mRNA 的表达水平。

结果与假手术组比较，模型组Bcl-2和Bax 显著升高，差异具有统计学意义（P ＜0.05）；与
IR 组比较，SLIGRL-NH 2（1、3mg ）组的Bcl-2显著升高、而Bax 显著降低（P ＜0.05 0.01）。

结论
I /R 可诱导大鼠心肌组织Bcl-2、Bax mRNA 表达上
调，而PAR-2活化可通过抑制心肌组织Bax mRNA 的表达和促进Bcl-2mRNA 的表达，起到抑制心肌细胞凋亡的作用。

〔关键词〕蛋白酶激活受体2；缺血再灌注损伤；细胞凋亡；Bax ；Bcl-2〔中图分类号〕R34
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0548-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.048
通讯作者：李莉（1977-），女，硕士，主治医师，主要从事冠心病的基础及临床研究。

第一作者：刘
阳（1975-），女，主管护师，主要从事冠心病的临床护理
及相关研究。

近年研究表明，蛋白酶激活受体-2（PAR-2）活化能明显缩小心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion ，I /R ）后的梗死面积，改善心脏功能
〔1〕
，但其机制尚未完全清楚。

本实验采用大鼠心肌
IR 模型，观察不同剂量的SLIGRL-NH 2活化PAR-2对大鼠心肌组织Bax 、Bcl-2mRNA 表达的影响。

1材料与方法1.1
实验分组及处理
体重220 250g 的雄性SD 大鼠40
只，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，动物合格证号为
〔SCXK （鄂）2004-0007〕。

随机分为假手术（sham ）组、I /R 组和SLIGRL-NH 2（0.5，1，3mg ）组，每组8只。

SLIGRL-NH 2组：再灌注前5min 经颈外静脉注射0.5、
1、3mg /kg SLIGRL-NH 2，假手术组和I /R 组注射等量生理盐水作为对照。

SLIG-RL-NH 2（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）。

1.2
试剂与仪器
TRIZOL REAGENT ，美国Invitrogen 公司产
品；SYBR ExScript TMRT-PCR kit （Perfect Real Time ），Takara 公司产品；荧光定量PCR 扩增仪，美国MJ Research 公司产品。

1.3
动物模型的制作
按文献
〔2〕
复制模型，以3%戊巴比妥
钠（30mg /kg ）腹腔注射麻醉大鼠，气管切开插管连接微型动物呼吸机。

辅助呼吸参数为：呼吸频率50次/min ，潮气量20ml /kg ，呼吸比1ʒ1。

大头针穿刺四肢皮下接心电图机记录一段正常心电图作为对照。

开胸、暴露心脏。

I /R 组和SLIG-RL-NH 2组以5/0缝线在左冠状动脉前降支根部穿线，在前降支上垫一塑料管一同结扎，缺血30min 后，剪断结扎线再灌注120min 。

假手术组仅在左前降支下穿线不结扎，旷置150min 。

1.4大鼠心肌组织Bax 、Bcl-2mRNA 表达的检测1.4.1
抽提总RNA
心肌组织样本用TRIZOL Reagent 提取
总RNA ，按操作说明书进行。

紫外分光光度分析及琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 的含量、纯度及完整性。

引物序列如下：①目
·845·中国老年学杂志2012年2月第32卷。