影响ELISA方法的因素与分析

影响ELISA方法的因素与分析

【摘要】目的：了解影响酶联免疫吸附法（ELISA）的因素。方法：对ELISA方法操作的程序及结果进行分析。结果：影响ELISA结果的常见因素有加样，反应时间，洗剂等。【关键词】：酶联免疫吸附测定；影响因素

酶联免疫吸附测定（ELISA）是20世纪70年代发展起来的一种检测技术，其特异性强，灵敏度高，操作简单，在医学检验有广泛的应用，为辅助临床诊断起到了积极的作用［1］。但影响ELISA测定的因素较多，操作过程中每个环节都会对实验结果产生影响。现对影响实验结果的常见因素进行探讨分析：

1标本的采取和保存

大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测，如有细菌污染，菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶（HRP），也会产生假阳性反应。一般来说，在5 d内测定的血清标本可放置于4°C下保存。若在冰箱中保存时间过长会导致IgG聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需要-20°C保存。抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。

2试剂的准备

试剂在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。洗剂来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗剂以清除残留在板孔没能与固定相抗原或抗体结合物质，以及在反应过程中非特异性吸附的干扰物质洗剂下来。洗剂是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗剂，不得马虎。洗板时应注意各种试剂盒的洗液不要混用，如果洗液需要稀释，应按要求稀释，洗液如果结晶应待其溶解后配制。

保证洗板浸泡时间为40s左右，孔内液体被洗板机吸收的越干净洗剂效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。

3 检测过程中各环节应注意事项

3.1加样

加样时，样本应加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。

3.1.1 样品稀释液少加，或血清多加，都会引起本底增高。对于间接法来说，受上述两个因素的影响更大。因为血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异性IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异的IgG 均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多，高于规定的稀释倍数，必将带来阴性高值。假阳性产生的原因分析：如结缔组织病（系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤）等病症时，血清中的风湿体和其他特异性IgG(IgG浓度达50mg/ml)会引起本底升高或假阳性［2］。另外，当溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血液中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，当其通过吸附或“pp”效应（蛋白质间相互吸附的现象）结合后，可催化A,B液显色而造成假阳性［3］。

3.1.2 酶结合物的不正确加入。一般来讲，酶也有一定的非特异吸附，将包被好的酶联板再封闭，一方面也可以避免酶的非特异性吸附。通常每空加入的封闭液为120ul。如果加入酶多于120ul，或加入在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。

3.2保温

实验表明，在建立ELISA方法作反应动力学分析时，两次抗原抗体反应一般在37°C经1-2h，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的试剂盒温度是在空气浴中完成。采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘的位置。

3.3显色和比色

四基联苯胺[TMB],经辣根过氧化酶[HRP]作用后，约40min显色达高峰，随即逐渐减弱，至2h后即可完全消退至无色。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温在15-30°C。仪器使用前吗，先预热15-30min，测度结果更稳定。

3.4 温育

3.4.1 由于试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点，升高反应的温度，会加快反应，同样增加时间会延长反应，这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应程度多，也会引起阴性高值或假阳性。

3.4.2 由于试剂盒通常设定的反应温度为37゜C，在这个温度下放置30分钟，蒸发的水分会很多，对于整个反应体系来说，各种反应物的浓度会不断增加，这样必会导致反应最后的值

升高。因此温育时应盖上胶贴。

3.4.3 试剂盒的温育过程是在培养箱中进行的，这和水浴的条件不一样。水浴可使酶联板迅速升温，但是较难将温度控制在较稳定的温度，往往高于37゜C，同样会引起高值阴性。

3.5洗板

3.5.1 各个厂家使用的洗液配方是不同的，是根据各自试剂的条件配置的，采用不配套的洗液常会得到不正常的反应结果，包括本底过高。一家公司的洗液采用独特的洗剂系统不能和其他公司的试剂盒混用。

3.5.2 试剂盒中提供的洗液是浓缩的，应该稀释到规定的倍数使用，过多稀释洗液，会影响洗液的效果，而是反应的本底过高。

3.5.3 稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水，电导率小于1.2us。如果水中含有过多的钙离子,镁离子，这些离子会占用表面活性剂，影响洗剂效果。

3.5.4 洗板时，应该每孔加满洗液，如果加入的洗剂液量不够，对洗剂的效果影响也是很大的。一家公司的酶联板板孔为400ul，比别家的板孔大，因此洗了别公司的板后要及时调整液量，以免加液量不满。

3.5.5 洗板的次数不够孔内多余的抗原（抗体）或酶结合物不能彻底去除，也会因此本底升高。

3.5.6 洗板的强度和洗板浸泡的时间是密切相关的，洗板机不同，使用的泵不同，液体加入使得冲力不同。如果加入洗液的冲力不大，也没有设定浸泡时间同样会使结果的A值偏高。

3.5.7 洗板完毕后，要进行排板，尽量采用质量好的毛巾和吸水纸，使用易拔掉渣的纸，纸屑会留在孔板中，由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。

3.6 显色

加A,B液准确，顺序不能颠倒，要及时终止显色。终止后要在3分钟之内读数，否则强阳性会变低

3.7 枪头，加样槽或其他来源的污染

如果使用的枪头，加样槽是反复使用的，必须肯定没有来自酶或阳性的污染。酶作为反应的催化剂，及其微量也会明显影响反应。如果枪头使用84消毒液浸泡而没有冲洗干净，因为84是强氧化剂，加入AB液后就会显色。

3.8测A值时，微孔条底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面都可能引起A值的升高。4讨论

虽然ELISA操作步骤简单，但格环节都不可忽视。温育时间及温度、显色反应时间长短、试剂标本加入量、操作速度、洗板液的配置等各个方面都要严格操作规程，重视每一步操作细节，这样才能作出可靠的结果。

参考文献

［1］王玉兰. 临床免疫学和免疫学检验［M］.3版。北京：人民卫生出版社，2003:91-92. ［2］陈慰峰. 医学免疫学［M］.4版。北京：人民卫生出版社，2004:244-245.

［3］伍伟健，郭如华.ELISA试剂灰区设置方法的探讨［J］.中国生物制品学杂志，2008,21（10）：911-912.