昆虫细胞的培养

昆虫细胞培养及其应用进展
摘要: 随着生命科学的迅速发展, 细胞工程愈来愈受到人们的重视。

以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值, 已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。

本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展, 包括昆虫细胞培养基研究开发, 昆虫细胞系的建立和组织培养, 利用生物反应器大规模培养昆虫细胞, 昆虫细胞2杆状病毒表达系统,构建基因工程细胞系及其稳定性表达, 以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。

关键词: 昆虫细胞系; 昆虫细胞培养; 基因表达;培养条件昆虫的组织培养最早始于1915 年, 直到1962 年Grace 才成功建立了世界上第一个细胞系, 此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展, 不断有新细胞系建立的报道。

现在, 昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。

1昆虫细胞培养基
昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段. 天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液. 合成培养基最大的特点是各种成分已知.无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上, 在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子, 能够保证细胞生长良好无须补加血清的培养基. 昆虫细胞培养基的发展主要是合成培养基的发展.[1] 体外培养昆虫组织的首创者是R ichard Ben2dict (1915), 但他当
时没有合适的昆虫细胞培养基。

T rager 首次研究了培养基中昆虫细胞的生长条件, 目的是证明单个细胞能在体外存活几天, 并利用昆虫细胞培养基研究昆虫和哺乳动物病毒。

1956 年, Silver W yatt 改进了用于家蚕(B om byx m ori L innaeus) 蛹的培养基, 成功地使细胞存活了14d。

他的培养基含有浓度与家蚕血淋巴成分相应的21 种氨基酸、5 种盐、3 种有机酸、以及果糖、海藻糖和葡萄糖, 并相应调解了pH 值和渗透压, 这为昆虫细胞培养基的研究奠定了重要的基础。

1956 年就在W yatt 发表论文时, Grace 在W yatt 的培养液中增加了胆固醇、内分泌腺和卵巢组织的提取物以及含有10 种B 族维生素的混合物, 使4 龄家蚕幼虫的卵巢细胞存活了29d。

从此, 昆虫细胞培养基的研究便迅速发展起来。

到目前为止, 至少已报道了60 多种昆虫细胞培养基。

许多昆虫培养基配方正不断得到改进, 以使之适于细胞生长。

最通用的商品培养基Grace氏培养基、TC2100、IPL 241、TNM 2FH 以及经改良的哺乳动物细胞培养基TC1992M K 等。

TC2100 适合于苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒在草地贪夜蛾细胞系(Sf9 细胞系) 中生长, 但它仅适用于实验室而不适用于大规模培养, IPL 241 提高了昆虫细胞系的生产规模, 利于杆状病毒的有效生产。

这些培养基是呈液体或粉剂的商品, 使用时通常补充5%～10% FBS(牛血清) 和一些蛋白水解物或抽取等复杂添加剂。

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基, 含有丰富的细胞生长所必要的营养成分即提供生长因子、脂类、蛋白及无机盐。

细胞培养的关键是培养基配方的开发, 已有多种培养基用于支持昆虫细胞系的生长。

昆虫细
胞培养所用培养基一般均补加FBS, 血清提供了细胞生长过程中所需的营养物质和微量元素, 使细胞能健康生长和传代。

但是FBS 的使用也存在着缺点: ①价格高; ②每批血清的质量不同, 影响细胞的生长和病毒复制; ③血清中的蛋白影响从培养的上清液中分离和提取重组蛋白, 使蛋白的纯化更加困难;④血清易被支原体污染。

由于部分加入胎牛血清或牛血清使典型昆培养基变得很复杂。

因此, 无论工业上或学术上, 开发无血清培养基都是必然的趋势。

昆虫细胞无血清培养基的研究始于20 世纪60 年代末和70 年代初, 发展无血清培养基, 必须寻找适当的具有类似于血清功能的因子, 由于血清成分复杂, 具有多种促细胞生长和增殖因子, 因此要找到血清的替代物是相当困难的。

目前, 通常的添加物有酵母自溶物、蛋白胨、胰蛋白胨、蛋黄乳液、酵母抽提物水解乳蛋白及微量元素等。

近年来已先后研制出多种无血清或低蛋白培养基如SFM 25、CDM、Sf2900˚、Excell400、ISFM 等, 但缺点是适用范围小。

CDC 培养基的出现, 打破了无血清培养基的局限, 它既可用于双翅目细胞培养, 又可以用于鳞翅目细胞系的培养, 而且不需要预先的适应步骤。

由于在无血清培养基中含有从血清或动物脏器中纯化的蛋白成分, 如胰岛素、转铁蛋白、白蛋白和脂蛋白等, 增加了分离纯化的难度和成本。

细胞在无血清低蛋白或无蛋白培养基环境中对剪切应力更为敏感, 故需适当提高保护剂的浓度如FluronicRF68 到0. 3%。

无血清培养基的应用有时会降低重组蛋白的产量, 在无血清培养基内, 较高的细胞生长密度与相对较低水平的重组蛋白产量这一事实表明, 促进细胞分裂的因子与促进重
组蛋白生产的杆状病毒感染晚期起作用的因子是不尽相同的。

无血清培养基配方还需进一步改进以便适应于重组蛋白的表达。

[2]
2昆虫细胞系的建立
昆虫细胞培养的奠基人是德国的R ichardBendict(187821958), 他在1915 年发表了有关昆虫细胞培养的第一篇论文。

1956 年W aytt 在分析蚕淋巴化学成分的基础上, 模拟昆虫的血淋巴, 设计出最早的昆虫组织培养液。

Grace 对W yatt 的培养基配方作了一些改进, 并首先建立了 4 个桉蚕蛾卵巢细胞系(1962)。

虽然已建立了很多的昆虫细胞系, 但迄今为止, 研究和应用得最多的是草地贪叶蛾(Spodop tera f rug iperda)卵巢细胞系Sf21 及其克隆株Sf9 和粉纹夜蛾(T richop lusiani) 胚胎细胞系BT I2Tn52B124 (商业上称之为H igh Five)。

昆虫细胞进行原代培养时, 为了克服微生物污染的问题, 可以对室内养虫进行体表消毒和在培养基中加入抗生素, 但传代培养时培养基中加入抗生素对细胞生长不利。

最初培养的昆虫细胞主要以血细胞、成纤维细胞为主。

而现在已建立的细胞系则主要来源于未发育成熟组织, 如胚胎、器官芽和卵巢。

用未成熟或未分化的组织建立细胞系比用成熟组织容易, 主要是因为其中干细胞含量高。

未成熟组织的细胞系建立早于成熟组织细胞系, 1962年Grace初次建立了4个桉蚕卵巢细胞系,在此之后又相继建立了多种未成熟组织的昆虫细胞系。

1985年M itsuhashi等成功地建立了昆虫血球细胞系, 而对神经细胞、肌肉细胞、体壁细胞、马氏管、唾腺、脂肪体细胞进行离体培养仅存活一段时间。

已有许多研究者尝试用成熟组织建立昆虫细胞系,
但不易成功。

最近, 洪华珠建立了一株来自粉纹夜蛾(T richop lusia ni) 脂肪体的传代细胞系,Boyce 研究所也成功地建立了美洲粘虫中肠的细胞系。

不管细胞来源是成熟组织还是未成熟组织, 细胞的原代培养均须经物理或酶解的方式将组织解离, 产生组织碎片或细胞悬液。

原代培养初期细胞有一段时间需要适应新的外界环境, 细胞产生形态变异, 表明了细胞已开始生长, 细胞增长率的提高是其传代培养的一个前提。

到目前为止,全世界建立的昆虫细胞系有800株以上,分别来源于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、蜚蠊目、膜翅目、直翅目、同翅目和半翅目等8 个目的170多种昆虫,然而其中大部分来自鳞翅目和双翅目,来源于其他目的昆虫细胞系仅占1Π10 左右(图1 ,个人统计) 。

由于草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda 细胞株Sf 9 和Sf 21 ,以及粉纹夜蛾Trichoplusia ni 细胞株Tn5B124(商品名High Five) 对模式病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Autographa californica multicapsidnucleopolyhedrovirus(AcMNPV)非常敏感,因而成为各实验室普遍采用的细胞系(Granados et al. ,1994) 。

[3]
3生物反应器大规模培养昆虫细胞
高效培养的方法是昆虫细胞大规模培养的关键, 昆虫细胞的培养条件与哺乳动物细胞基本相似, 现有的大部分昆虫细胞培养技术也是由动物细胞培养方法改进而来, 昆虫细胞培养系统大致可分为两种类型: 一类的生长细胞附着在培养器壁或其他支持物的表面; 另
一类的生长细胞悬浮在液体培养基内。

前一类通常称为机质依赖型或停泊依赖型培养, 后一类称为悬浮培养。

用生物反应器技术进行细胞悬浮培养是当今的研究热点,因为这项技术已成功应用于微生物与哺乳动物细胞的工业化生产。

已有一些用转瓶、涡旋罐、空气补给生物反应器等不同类型容器进行昆虫细胞悬浮培养的研究报道。

除了悬浮培养外, 昆虫细胞也可固定在高分子机质内或吸附在高分子聚合膜表面。

由于昆虫细胞培养系统需氧量很高, 大量输氧操作如搅拌、喷气等都是必需的, 但这些操作产生的水剪切应力, 往往引起细胞的损伤和死亡。

这个问题目前已经成为细胞大规模培养的关键性限制因子。

大规模培养昆虫细胞时要考虑的因素很多,如生物反应器的设计、氧气转运、剪切应力、细胞密度、培养基组分以及装备成本等。

在多数场合,大规模培养昆虫细胞用于生产重组杆状病毒表达外源蛋白, 都是作为间歇工艺流程进行的, 因为所有的细胞都因病毒感染的细胞病理效应(CPE)而引起死亡。

用这一方法, 往往可以简单地预测何时去收获感染细胞。

迄今, 由于“传代效应”的影响,连续或半连续生产杆状病毒的研究取得的成果有限。

昆虫细胞进行悬浮扩大培养时, 细胞的敏感性问题是首先要解决的。

搅拌槽生物反应器是当今生物工程领域的主要培养装置, 可以在液体表面通气, 也可以在反应器底部通气, 培养基内需添加甲基纤维素或FluronicRF68 等保护剂。

根据昆虫细胞培养特点, 要求搅拌器转动时产生的剪切力小, 混和性能好, 围绕这两项要求, 已开发了不少形式的搅拌器, 迄今为止, 每年仍有不少这方面的论文和专利陆续发表。

Sasaki 在搅拌浆上安装疏水性的
聚丙烯膜以实现无泡通气搅拌, 在这种改进的搅拌反应器内, 以灌注方式培养Sf21 细胞, 其密度可达2×107个/mL , 对数生长期可维持7 d 以上。

Kamem 在11 L 带有螺旋浆式搅拌器的反应器内培养Sf9 细胞, 这种搅拌器在低转速和低剪切的前提下, 能获得良好的混合与传质效果。

利用此装置, 在表面通气的情况下, 细胞密度可达到5. 5～6. 0×106个/mL , 细胞成活率高于98% ,106个细胞中异源蛋白产量可达5 Λg。

由于相对低的细胞密度与产物浓度已在一定程度上限制了昆虫细胞的培养。

目前, 焦点之一是寻找一种细胞培养方法, 既能提高细胞密度又能增加细胞产物, 同时能够降低生产成本。

固定化昆虫细胞培养作为一项新技术, 近年来发展很快,A gathos 采用胶原蛋白为基质的微珠来固定化培养蚊子细胞, 密度高达2×107个/mL。

King 采用海藻酸2聚L 2赖氨酸制备微囊来培养昆虫细胞, 细胞密度可达8×107个/mL。

固定化培养的另一有效方法是堆积床, 为贴壁培养方式的一种, 昆虫细胞贴壁生长在颗粒状球上, 并在气升式反应器的降液区形成堆积床, 而升液区则进行通气供氧。

堆积床法由于可提高培养表面积, 同时又能保持充足的供氧, 因此有很好的发展前景。

在体外培养昆虫细胞工作中,为了保种和长期保存昆虫细胞的活性,必须将细胞进行冷冻保存,并在需要时进行复苏培养。

Knudson 和Bckley曾指出,脊椎动物细胞冻存方法也适用于昆虫细胞的冻存,但在冻存和复苏的方法上不尽相同。

Spallanzani 在1776 年最早发表了冷处理对细胞生命活动的影响报道。

1949 年,Polge 等人发现
了甘油对低温贮存的细胞的保护作用。

1959 年,Lovelock 等人发现了一种新的化学保护剂,这就是人们所熟知的二甲亚砜(dimethylsulfoxide ,DMSO) 。

但三桥淳指出,以甘油作为保护剂来冻存昆虫细胞同样可以取得很好的效果[4]。

离的中肠细胞一般是在细胞培养瓶或培养板中进行离体培养,贴壁的组织和细胞更容易培养成功,贴附和伸展因子可诱导细胞的伸展,层粘连蛋白和胶原家族的分子可以促进动物上皮细胞生长和分化,其中I型胶原分子的效果较好(刘芳宁和张彦明,2 0 0 7)0但是,Zhang 等(2 0 0 9)在培养中华蜜蜂中肠细胞时发现I型和I V型胶原蛋白并未对细胞贴壁起促进作用。

S a n c h e z等(2 0 0 4)设计了一种促进中肠细胞贴壁的技术,在两层盖玻片中培养红脂大小蠹中肠细胞,在上面盖玻片的压力(71mg/ 0.8c m2)下促进细胞的生长,这有利于中肠细胞在离体条件下极性分化的产生,为中肠细胞离体培养技术开启了一个新的思路。

[5]
4 昆虫细胞系的应用
4.1
昆虫细胞系在基础医学研究中的应用
在基础医学方面, 利用昆虫细胞研究虫媒病毒、以及病毒在昆虫细胞中的发育和侵染; 利用昆虫细胞系研究人类疾病基因; 利用昆虫细胞系检测药物, 特别是抗癌药物, 进行毒理学研究; 还有学者应用昆虫细胞系研究昆虫细胞的凋亡和细胞周期调控, 这些研究为进一步探
讨人类细胞凋亡机制及某些疾病治疗提供了实验基础。

细胞周期调控备受关注。

果蝇的细胞周期蛋白Cyclin D在胚胎发育的不同时期表达, 而 D 型周期蛋白的表达增高, 可以在许多类型的癌细胞中被检测到, 是细胞癌变的一个重要标记性蛋白。

有关细胞周期调控蛋白CycD在果蝇发育中的调控机制, 为肿瘤细胞突变机制的研究奠定了很好的基础。

同时也有助于找出抑制肿瘤细胞分裂的方案。

4.2
基因工程- 昆虫杆状病毒表达系统
自1983年Sm ith等创建了昆虫杆状病毒表达载体系统( BaculovirusExpressionV ector System,BEVS ) 以来, 昆虫细胞作为重组病毒的表达载体得到了更快更好的发展。

利用病毒昆虫细胞表达系统高效表达人体基因, 获得具有治疗疾病的干扰素等蛋白质、多肽和其他具有生物活性的物质, 并最终利用昆虫细胞系作为生物反应器、生产基因工程药物和疫苗。

利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中表达人纤维介素蛋白 2 (hfgl2) 凝血酶原酶并检测其蛋白活性, 为开发重型肝炎蛋白芯片或ELISA诊断试剂盒提供阳性对照, 也可用于血清特异性抗体的检测, 更为研究该蛋白体外功能学提供了有利的工具。

姚文荣等构建狂犬病毒核蛋白( NP) 基因的重组杆状病毒表达载体, 在昆虫细胞中表达具有免疫原性的狂犬病毒核蛋
白, 结果证实该表达产物可以用于狂犬病的检测及诊断。

用RT- PCR 方法扩增兔出血症病毒(RHDV ) 衣壳蛋白VP60基因, 通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bac- m id-VP60, 用此质粒转染Sf9细胞, 得
到重组病毒rAcV - Bac-VP60, 为兔病毒出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。

4.3
昆虫细胞系在杀虫剂研究中的应用
既往在研究杀虫剂药效、毒性作用机制及昆虫抗药性等方面, 主要采用活体昆虫进行相关研究。

但活体生物测定需要的周期长, 昆虫对药剂的敏感性受季节、温度以及品系等因素的影响较大, 其结果需要校正。

为寻找更好的研究方法, 近年来有部分学者应用昆虫细胞系研究杀虫剂毒性。

许名飞等应用美国棉铃虫细胞研究灭多威对该细胞基础代谢热值的影响, 提示应用昆虫细胞可以为药物毒理研究提供参考。

也有学者通过八种昆虫离体细胞系对灭多威农药的敏感性进行研究。

本课题组利用MDEC- 07114对灭多威的毒效进行测
定, 并从细胞水平就药物对MDEC- 07114细胞周期以及超微结构的影响进行研究。

昆虫细胞可在严格控制的实验条件下,简化影响因素, 并且细胞生长周期短、耗药极少, 进行毒力测定精度高、重复性好, 可同时进行多个药剂的筛选, 更能满足化学杀虫剂和天然源杀虫剂筛选所需的快速和准确的要求, 为杀虫剂开发研究、药效筛选提供实验基础。

目前由于化学杀虫剂引起的抗药性日益严重以及造成的环境污染, 使生物杀虫剂成为国内外害虫防治技术的一个新的发展方向。

生物杀虫剂主要包括细菌杀虫剂, 如苏云金杆菌( Bt); 杀虫抗生素, 如Success, Conserve,Tracer,Spin Tor;真菌杀虫剂, 如白僵菌制剂Boverin。

[6]
参考文献:
1、张佑红, 朱雄伟, 陈燕.昆虫细胞培养及其应用进展. 武汉化工学院学报.第28卷. 第3期. 2006年05月
2、李守信, 李长友, 郑桂玲等. 昆虫细胞培养研究进展. 西北农业学报2005, 14(3): 41～48
3、宋德伟, 马艳, 冯颖. 昆虫细胞工程研究进展. 林业科学研究2004 ,17(1) :116 ～124
4、张寰、张永、安秦启联等. 昆虫细胞系的培养和建立技术.昆虫学报, Acta Entomologica Sinica , August 2007 , 50(8) : 834 - 839
5、闫玉涛, 贺莉芳,刘晖等. 昆虫细胞培养及应用医学动物防制，2010年8月第26卷第8期
6、童丹丹,吴艳蕾,郑桂玲等.昆虫中肠细胞的离体培养. 环境昆虫学报,May2 01 3,3 5(3):3 9 0-3 9 8。