IRS_1IRS_2蛋白质在PCOS患者脂肪组织中的表达

第30卷第4期济 宁 医 学 院 学 报2007年12月Vol 30,No 4JOURNAL OF JINING M EDICAL COLLEGE Dec,2007
IRS-1IRS-2蛋白质在PCOS患者脂肪组织中的表达
初永丽1 邱红玉2 姜学强1 孙永玉2
(1山东省烟台毓璜顶医院 2华中科技大学同济医学院附属协和医院)
提 要 目的 研究多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)患者脂肪组织胰岛素受体底物-1(Insulin receptor substeate-1,IRS-1)及胰岛素受体底物-2(Insulin receptor substeate-2,IRS-2)蛋白的表达,探讨PCOS产生胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)的分子机制。

方法 采用放射免疫法检测PCOS IR组(20例)、PCOS非IR组(15例)及对照组(20例)血清空腹胰岛素(Fasting insulin,FIN)的浓度;采用葡萄糖氧化酶法测定血浆空腹血糖(Fasting plasma glucose,FPG);采用HOMA(Homeostasis model assessment, HOMA)模型计算胰岛素抵抗指数(H OMA-IR);采用Western blot方法检测IRS-1及IRS-2蛋白的表达。

结果 (1)PCOS IR组患者血清FIN及H OMA-IR均显著高于PCOS非IR组与对照组(均P<0.
05);PCOS非IR组患者血清FIN及HOMA-IR亦显著高于对照组(均P<05);(2)PCOS IR组与PCOS非IR组及对照组相比,IRS-1蛋白表达量明显下降(P<0.05),而IRS-2蛋白表达无显著性差别。

结论 PCOS患者脂肪组织IRS-1蛋白表达的下降所导致的受体后信号转导障碍可能是其产生胰岛素抵抗的机制之一。

关键词 多囊卵巢综合征;胰岛素抵抗;胰岛素受体底物-1,胰岛素受体底物-2
PCOS是生育年龄妇女常见的极为复杂的内分泌疾病,典型临床特征有:月经紊乱、慢性无排卵及不孕、双侧卵巢增大、高雄激素血症(H yperandro genism,HA)、LH过度分泌等。

但现代观点认为该综合征还存在显著的糖代谢异常,主要表现为胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)及高胰岛素血症(H y perinsulinism,H I),而且成为其重要发病机理。

近年来,IRS-1及2作为胰岛素受体后信号转导分子在PCOS胰岛素抵抗发病机制中的作用逐渐引起重视,但关于其PCOS脂肪组织的研究国内外尚无相关报道。

1 资料与方法
1 1 研究对象
选择自2001年9月至2005年12月诊断为PCOS的患者30例,平均年龄27岁,诊断标准[1,2]: 临床表现:月经紊乱(闭经、月经稀少或功血)、多毛、痤疮、肥胖、不孕等;血性激素水平:黄体生成素(LH)与促卵泡素(FSH)比值!2,或者雄激素水平升高;并排除垂体、肾上腺和甲状腺等内分泌疾病;∀B超检查:至少一侧卵巢有10个以上直径2~ 8mm的卵泡,卵巢基质回声增强;#卵巢的病理表现于术中及术后证实。

所有PCOS病例中有16例施行卵巢楔形切除术,14例施行腹腔镜卵巢打孔术。

选择因单纯子宫肌瘤施行子宫切除术的病人20例为对照组,血清性激素、空腹血糖及胰岛素检查均在正常范围,平均年龄28岁,与PCOS组年龄匹配。

胰岛素抵抗诊断标准参照∃内科疾病诊断标准%(第1版)[3],因高胰岛素血症是胰岛素抵抗的定性指标,所以本实验胰岛素抵抗的筛选指标为空腹血胰岛素>20 IU/mL[4],以此为实验分组依据,筛选出20例设为PCOS IR组;15例为PCOS非IR 组。

所有对象排除糖尿病家族史及其他内分泌疾病,3个月内无激素类药物应用史,无心、肝、肾疾病史等。

1 2 标本收集
所有受试者于月经干净后5~7d(闭经者日期不限,但经B超检查没有优势卵泡时),空腹采集静脉血4ml(不加抗凝剂),2000rpm离心15min,分离血清,-20&保存备用。

血浆葡萄糖当时测定。

脂肪组织于术中留取,迅速置于液氮保存待用。

1 3 实验方法
(1)采用放射免疫法测定血清空腹胰岛素。

血浆葡萄糖用氧化酶法测定。

试剂盒分别购自美国RANDOX及中国北方生物技术公司。

(2)稳态模型(H omeostasis model assessment, HOMA)法评价胰岛素抵抗的程度[5]
采用血浆空腹血糖(FPG)和空腹胰岛素(FIN)计算胰岛素抵抗指数,分析胰岛素抵抗的程度,
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烟台市科技发展计划项目(NO:2004221)
HOMA-IR=FIN (FPG/22.5[6]。

由于该指数呈偏态分布,故取其自然对数(LN)进行统计学分析。

(3)Western blot 检测IRS-1及2蛋白质的表达: 脂肪组织蛋白质的提取见文献[7],Bio -Rad 微量蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。

取蛋白样品50 g 进行SDS -PAGE 电泳,转膜,封闭,加入抗P85抗体(购自美国PharMigen 公司)孵育。

∀洗涤后加入HRP 标记的二抗,孵育,充分洗涤,DAB 显色液显色,PBS 终止。

Kodak Digital Science 1D 软件分析条带积分光密度值(OD),各条带值除以对照组平均值,得出相对值,进行半定量分析。

1 4 统计学分析
所有数值用 x )s 表示,采用SPSS10.0系统软件,应用单因素方差分析进行统计学分析,P <0.05有显著统计学意义。

2 结 果
2 1 PCOS IR 组、PCOS 非IR 组与对照组FPG 、FIN 及HOMA-IR 的比较
PCOS IR 组与PCOS 非IR 组及对照组相比,其FIN 、H OMA -IR 明显升高,差异均具有极显著性意义(P <0.01),PCOS 非IR 组FIN 、H OMA -IR 与对照组相比升高,差异有显著性(P <0.05);三组之间FPG 的比较无显著性差异(P >0.05)。

(见表1)
表1 各实验组F PG 、F IN 及HOM A-IR 比较( x )s )
分组n FPG(mmol/L)FIN( IU /mL)HOMA-IR PCO S IR 组19 4.54)0.7524.56)3.78*
1.61)0.31*
PCOS 非IR 组
10 4.23)0.2914.45)3.89
**0.92)0.27
**
对照组
15
4.11)0.45
9.76) 2.780.52)0.32
注:*PCOS IR 组vs PCOS 非IR 组及对照组P <0.01;**PCOS 非IR 组vs 对照组P <0.05;HOM A-IR 已经对数转化
2 2 三组脂肪组织IRS-1、IRS-2蛋白的表达免疫印迹分析显示PCOS IR 组IRS-1蛋白的表达显著低于PCOS 非IR 组及对照组(P <0.05),PCOS 非IR 组IRS-1蛋白的表达亦显著低于对照组(P <0.05),而IRS-2的表达三组之间无显著性差异(P >0.05)。

(图1,
2)
图1 脂肪组织IRS-1蛋白的表达
* PCOS IR 组vs 对照组P <0.05;** PCOS 非IR 组vs 对照组P <0.
05
图2 脂肪组织I RS-2蛋白的表达
* PCOS IR 组vs 对照组P >0.05;** PCOS 非IR 组vs 对照组P >0.05
3 讨 论
越来越多的学者认为:IR 及HI 不仅是PCOS 的另一重要生化特征,而且可能是PCOS 发生的主要病理生理基础及重要的发病原因。

而IR 的发病机制,尤其是其分子靶点及细胞内的信号转导机制受到极大关注,基础研究表明:在胰岛素受体后信号转导通路中,IRS 介导的磷脂酰肌醇-3激酶途径起关键作用。

本研究结果显示三组空腹葡萄糖无显著性差别,PCOS IR 组空腹胰岛素及HOMA-IR 显著高于其他两组;PCOS 非IR 组空腹胰岛素及HOM A-IR 亦显著高于对照组,提示PCOS 患者发生IR 时,胰岛素的靶组织,如骨骼肌、脂肪组织及肝脏对内源性或外源性胰岛素的敏感性和反应性降低,胰岛 细胞通过增加胰岛素的分泌来代偿组织对胰岛素敏感性的下降,以维持正常的血糖水平,于是便产生了HI 和 细胞功能活跃,并以此维持正常的血糖水平。

说明PCOS 患者胰岛的分泌功能具有足够的储备动力,其H I 系由于IR 所致[8]。

PCOS 非IR 组的实验结果提示即使没有空腹胰岛素升高,可能也存在IR,或者以后有发展为IR 的可能。

胰岛素首先与细胞表面的胰岛素受体结合并激活其 -亚基的酪氨酸蛋白激酶(Protein ty rosine kinase,PT K),PTK 再磷酸化胰岛素受体底物(如IRS-1)蛋白中特定酪氨酸残基,磷酸化的IRS 能与含SH2结构域的信号分子结合,从而活化细胞信号转导中起关键作用的多个分子,激活磷脂酰肌醇-3-激酶及RAS/RAF/MAPK 途径,作用于下游靶分子,以调节细胞的代谢、生长、分化等,因此IRS -1及2作为胰岛素信号胞内传导的重要分子,既是胰岛素受体酪氨酸激酶的底物,也是胰岛素多种生物调节作用的中间体。

本课题既往采用免疫组化技术研究了IRS-1及IRS-2在PCOS 脂肪组织中的表达,发现二者均表达于脂肪细胞的胞浆及胞膜,呈黄色细颗粒状,IRS-1表达的丰度大于IRS-2,PCOS IR 组IRS -1表达减少,IRS-2表达未见异常。

而在本实验中采用免疫印迹分析显示PCOS IR 组IRS-1蛋白
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的表达显著低于PCOS非IR组及对照组,PCOS非IR组IRS-1蛋白的表达亦显著低于对照组,而IRS-2的表达三组之间无显著性差异,与免疫组化研究结果一致。

由于胰岛素靶组织细胞内IRS-1蛋白水平的高低及其结构和功能状态(如酪氨酸磷酸化)是胰岛素信号转导的基础,当IRS表达降低或结构、活性发生异常时,胰岛素的胞内转导即受阻滞[9]。

本研究发现三组脂肪组织IRS-2蛋白的表达无显著性差异,但多数学者认为IRS-2导致胰岛素抵抗的作用更强烈[10],但尚需进一步的研究加以证实。

本研究结果从蛋白质分子水平推测PCOS IR 患者脂肪组织IRS-1蛋白表达的减少,可能引起下游激酶活性的改变,将减弱胰岛素信号转导,促进IR的产生,从而成为PCOS对胰岛素产生抵抗的机制之一,但其确切的原因及机制尚不清楚,有待于进一步深入的研究。

参考文献
[1]郑志群,李美芝,林益川,等.罗格列酮对多囊卵巢综合征胰岛素
抵抗及高雄激素血症的治疗研究.中华妇产科杂志,2002,37(5): 271
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的临床观察.中华妇产科杂志,2001,36(5):296
[5]M athew s DR,Hosk er JP,Rudenski AS,et al.Homeostasis model ass
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insuli n resistance by uncoupling phosphatidylinosi tol3-ki nase and its dow nstream si gnals in3T3-L1adipocytes.Di abetes,2001,50
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sulin receptor s ubstrate2-associated phosphatidylinositol-3∗k i nase activati on,and impaired atypical protein ki nase C(zeta/lamb da)activation in myotubes from obese pati ents w ith impaired gl u cose tolerance.Diabetes,2002,51(4):1052
(收稿日期 2007-08-28)
Protein Expression of Insulin Receptor Substrate-1and2
in the Adipose Tissue from Patients with Polycystic Ovary Syndrome
CH U Yongli,QI U Hongy u,JIAN G X ueqiang,et al
(Department of Obstetrics and Gynecology,Yantai yuhuang ding Hospital),
Abstract Objective To investig ate the protein expression of insulin receptor substrate-1and2in adi pose tissue from patients w ith polycystic ovary syndrome,and explore molecular mechanisms of insulin resistance of PCOS.Methods Samples from patients w ith PCOS with insulin resistance(n=20),PCOS w ithout insulin resistance(n=15)and controls(n=20)w ere collected.Serum fasting insulin(FIN)w as measured by radioim munoassay.Fasting plasm a glucose(FPG)w as m easured by ox idase assay.Insulin resistance index w as calculated using homeostasis model assessment(HOMA)to analyze the relationship betw een these markers and insulin re sistance.The abundance of insulin receptor substrate-1and2in adipose tissue w as assessed by Western blot. T he tyrosine phosphorylation of IRS-1w as measured by immunoprecipitation and enhanced chemilum inescent imm unoblotting technique.Results (1)T he levels of serum FIN and HOMA-IR in PCOS w ithout insulin re sistance w ere sig nificantly higher than that of control group(all P<0.05);T he levels of serum FIN and H OMA -IR in PCOS w ith insulin resistance were significantly hig her than that of PCOS without insulin resistance(all P<0.05);(2)The protein expression of IRS-1in PCOS with insulin resistance w ere significantly low er than that in PCOS w ithout insulin resistance and control group(P<0.05),but no significantly difference ex isted in IRS-2expression.Conclusion T he signal transduction malfunction because of decreased IRS-1protein ex pression in the insulin signal transduction pathw ay may be one of the mechanism leading to insulin resistance.
Key words Poly cystic ovary syndrom e;Insulin resistance;Insulin receptor substrate-1;Insulin receptor substrate-2
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