大孔载体固定化脂肪酶

2007年 8 月 The Chinese Journal of Process Engineering Aug. 2007
收稿日期：2006−11−02，修回日期：2006−12−25
基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：20636010; 50373003)；国家杰出青年基金资助项目(编号：20325622)；北京市科技计划基金资助项目(编号：
D0205004040211)
作者简介：蔡宏举(1976−)，男，辽宁省铁岭县人，硕士研究生，生物化工专业；谭天伟，通讯联系人，E-mail: twtan@.
大孔载体固定化脂肪酶
蔡宏举， 付大雁， 王满意， 周 鑫， 谭天伟
(北京化工大学生命科学与技术学院，北京市生物加工过程重点实验室，北京 100029)
摘 要：用自制大孔载体固定化脂肪酶，对固定化条件进行了优化，比较了固定化酶与游离酶的酶学参数. 结果表明，酶粉与载体质量比为1:1、固定化温度在20∼25℃之间、固定化时间1.5 h 的条件下，所得固定化酶的酶活最高. 固定化酶的最适pH 为8.5，最适温度为40℃，其热稳定性、操作稳定性都比游离酶高，4℃下保存7 d 后，酶活仍剩余94%.
关键词：大孔载体；脂肪酶；固定化酶
中图分类号：Q814.2 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2007)04−0773−05
1 前 言
脂肪酶(EC3.1.1.3)是一类特殊的酰基水解酶，能够在油−水界面催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、多肽合成等反应，在制药、试剂、食品加工、生物能源等方面有着很大的应用潜力[1,2]. 由于游离酶不易回收，很难重复利用，限制了其大规模应用. 因此脂肪酶催化技术的应用在一定程度上取决于固定化技术. 目前固定化载体的研究主要集中在多孔粉体材料[3]，如介孔材料MCF [4], MCM-41[5]等. Pandya 等[6]发现，孔径较大的MCF(15.3 nm)的酶固定化比孔径小的MCM-41(2.6 nm)效果好. 这是因为酶更易被固定在孔径较大的孔内，提高了单位载体上酶的固载量，因而提高了单位酶活. 黄磊等[7]以微孔陶瓷载体固定化脂肪酶，仅对部分改性条件优化的情况下，固定化酶活就已经与高贵等[8]用无孔硅藻土固定化脂肪酶的酶活相当. 但脂肪酶是大分子，如果载体孔径小，将会影响固定化过程中酶与载体内部的传质，也会影响固定化酶催化反应时底物与脂肪酶间的传质过程. 如果在固定化介质中增加大孔分布，则可以提高固定化过程的速度，提高底物与酶之间的传质速度，提高反应效率. 从以上分析可知，大孔径固定化酶载体材料更有优势，但目前这方面的研究较少.
本工作以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体，二乙烯基苯(DVB)为聚合交联剂，采用固液联合致孔方式，通过本体聚合制备了具有大孔结构的含环氧基的多孔载体. 载体上的环氧基团水解成羟基后，以戊二醛为偶联剂[9]，用载体偶联法固定化假丝酵母脂肪酶. 比较了固定化酶和游离酶的最适温度、pH 值及稳定性等参数.
2 实 验
2.1 材料和仪器
假丝酵母(Candida sp. 99-125)脂肪酶，酶活约13000 U/g ，实验室自产；甲基丙烯酸缩水甘油酯，纯度大于96%，美国ACROS 公司；二乙烯基苯(含量56%，用5%的NaOH 预处理，洗去阻聚剂等杂质)，淄博嘉龙化工科技有限公司；纳米碳酸钙(粒径小于80 nm)，广东嘉维化工实业有限公司；其他试剂均为分析纯.
StereoScan-250-MK3扫描电镜, Cambridge; Porosimeter PASCAL 140&240压汞仪，Thermo Electron Corp., USA ；Multyskan Spectrum 酶标仪，Thermo Labsystems ；GC-2010气相色谱，日本岛津公司. 2.2 实验方法 2.2.1 载体的制备
量取甲基丙烯酸缩水甘油酯5 mL ，二乙烯基苯2 mL ，甲苯和正庚烷各3.5 mL ，称取7 g 纳米碳酸钙，与上述液体一起放于50 mL 的三角瓶中，反复超声混合后，置于65℃超级恒温水浴中反应12 h. 所得固体经粉碎后，筛分收集0.335∼0.45 mm 粒径的颗粒，用乙醇抽提24 h ，然后用适量的0.1 mol/L HCl 于常温、搅拌状态下浸泡72 h ，并且每隔24 h 换1次HCl ，以除去碳酸钙，最后用去离子水冲洗至中性，密封湿态保存. 2.2.2 载体的活化
称取0.4 g 载体，65℃下用0.1 mol/L HCl 水解12 h. 用去离子水冲清洗至中性，加入10%的戊二醛酸性溶液25 mL ，室温下振荡反应12 h ，用去离子水洗去戊二醛，所得载体放于冰箱中保存.
2.2.3 固定化酶的制备
称取一定量酶粉，用pH 8.0的0.1 mol/L 磷酸缓冲液配成10 mg/mL 的酶溶液. 向装有0.1 g 载体的三角瓶中加入15 mL 配好的酶液，室温下在摇床中反应一定时间，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗固定化酶载体，直到洗液中不含蛋白质为止. 所得固定化酶放于4℃冰箱中保存.
2.2.4 脂肪酶含量的测定
脂肪酶含量的测定按照Bradford 的方法[10]进行，以牛血清白蛋白为标准.
2.2.5 游离酶和固定化酶水解活力的测定
均采用橄榄油水解法[11]. 40℃下，
1 min 水解底物产生1 µmol 脂肪酸为1个活力单位. 酶活回收率计算：
酶活回收率=固定化酶总活力/(加入酶液总活力−残液总酶活力).
2.2.6 脂肪酶催化十二酸与正辛醇反应合成十二酸辛酯
在50 mL 锥形瓶中加入9.5 mL 正己烷，0.2 g 十二酸和316 µL 正辛醇，同时加入0.2 g 固定化酶，0.4 g 变色硅胶以吸收反应产生的水. 反应在温度40℃、转速150 r/min 的摇床中进行. 2.2.7 酯合成转化率的测定
按照文献[1]的方法进行.
3 结果和讨论
3.1 载体孔结构的表征
实验制备的载体的扫描电镜照片见图1. 载体的液体致孔剂为甲苯和正庚烷(体积比为1:1)，浓度为100% (与反应组分GMA 和DVB 体积总和比为1:1)，加入的固体致孔剂CaCO 3的质量与整个液相(GMA, DVB 和液体致孔剂)的体积比为1:2，载体的交联度为40%(DVB 与GMA 体积比).
从SEM 照片可以看出载体的孔结构. 载体不仅具有微孔和大孔结构分布，还具有约2 µm 的贯通式超大孔. 这是固液联合致孔的特点(生成双孔结构)，液体致孔剂主要生成微孔，固体致孔剂与反应相不溶，并且部分颗粒因为表面自由能大而形成团聚，导致介质形成大孔和超大孔结构.
利用压汞法测定了载体的孔径(D )分布，如图2所示. 可以看出载体的孔径分布集中在2个区域，为典型的双孔分布，这与扫描电镜的结果一致. 从压汞法数据可知，载体150∼400 nm 的孔占总孔容积(V )的60%，直径2∼8 µm 的孔占总孔容积的14.9%，其他孔占总孔容积的25.1%，总孔隙率为59.82%，总孔容积为1.24 mL/g ，比表面积29.6 m 2/g.
图1 自制大孔载体的扫描电镜照片
Fig.1 SEM photographs of the carrier
图2 自制大孔载体的孔径分布
Fig.2 Pore size distribution of carrier
3.2 固定化条件的优化 3.2.1 酶用量的确定
在固定化酶时，平行称取0.1 g 载体6份，分别加入不同体积的10 mg/mL 酶液，并加入一定体积的缓冲液调整酶液体积到15 mL ，在室温下放入摇床中固定化1.5 h. 实验结果如图3所示.
单位质量载体能够固定的酶是有限的，当载体固定
的酶达到一定量后，继续加大酶量不会提高固定化效果. 从图3可见，当加入的脂肪酶质量增大到0.1 g ，即酶质量与载体质量比为1:1时，固定化酶的活力回收率达到最大值，再增大酶量，酶活开始趋于不变，固定化酶的
100
1000
10000
1
23d V /d (l o g D )
Pore diameter (nm)
第4期 蔡宏举等：大孔载体固定化脂肪酶 775
活力回收率反而下降. 这是因为载体上酶的结合位点已被酶所占据，继续增大给酶量，载体也不能键合更多的酶. 所以，确定固定化酶的最佳给酶量为0.1 g 载体配0.1 g 脂肪酶.
图3 给酶量对酶固定化效果的影响
Fig.3 Effect of lipase loading on immobilization of lipase
3.2.2 固定化温度的确定
温度影响分子热运动的速度，在相同的固定化时间内，它将直接影响酶的固定化效率. 温度过低不利于传质及酶与载体的结合，过高则会使酶失活. 因此，固定化时温度的选择十分重要. 本实验在不同温度下固定化酶的结果见图4. 由图可见，在20∼25℃固定化时，脂肪酶比较稳定，不易失活. 温度升高，固定化酶活力上升，主要是因为传质速度随温度的升高而加快；温度高于25℃后，脂肪酶不稳定，失活很快，固定化酶的活力回收率也下降很快. 因此，固定化温度控制在20∼25℃时，效果最佳.
图4 反应温度对酶固定化效果的影响
Fig.4 Effect of temperature on immobilization of lipase
3.2.3 固定化反应时间的确定
平行称取0.1 g 载体6份，在25℃下，按酶与载体质量比1:1进行固定化，于不同时间取样测定酶活，结果见图 5. 可以看出，随着固定化时间延长，固定化酶
酶活先增长，而后趋于稳定. 本实验对假丝酵母脂肪酶的固定化在1∼1.5 h 的酶活最好，固定化时间短，优于文献[7]报道的4 h ，
这是因为载体中大孔结构的存在使酶在固定化时扩散速度快，短时间内就能完成固定化过程，降低了酶因为固定化时间长而失活的风险.
图5 固定化反应时间对酶固定化效果的影响
Fig.5 Effect of reaction time on immobilization of lipase
3.3 固定化酶的酶学性质 3.3.1 pH 对酶活性及稳定性的影响
分别平行称取自由酶和固定化酶各7份，于不同pH 下测定酶活，结果见图6，可见固定化酶pH 值在7∼9时活性都比较好，pH 值在7时相对活力仍保持65%以上；而自由酶活性对pH 的变化很敏感，只在pH 8∼8.5范围内保持较好的活力. 这说明固定化酶受微环境pH 值的影响比游离酶小，适用的pH 范围比游离酶的广.
图6 不同pH 下自由酶和固定化酶的酶活
Fig.6 Activities of free lipase and immobilized lipase under
different pH values
为测定pH 稳定性，平行称取游离酶和固定化酶各4份，在不同pH 值(室温)下保育8 h 后于pH 8.0下测定酶活，以无保育条件下的酶活为100%计算，结果见表1. 可见，在各pH 值下，固定化酶的pH 稳定性相对于游离酶都有较大幅度的提高.
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2 1.4
1.6
150200
250
300
350
510
152025
Mass ratio of lipase to carrier
A c t i v i t y o f i m m o b i l i z e d l i p a s e (U /g )
A c t i v i t y r e c o v e r y (%)2025303540
45
100
200300400
510152025
Recation temperature (℃)
A c t i v i t y r e c o v e r y
(%)A c t i v i t y o f i m m o b i l i z e
d l i p a s
e (U /g )
1
2
345
375
400
425
450475A c t i v i t y o f i m m o b i l i z e d l i p a s e (U /g )
Reaction time (h)
6
7
89
10
3000
6000900012000100200
300
400
A c t i v i t y o f i m m o b i l i z e d l
i p a s e (U /g )A c t i v i t y o f f r e e l i p a s e (U /g )
pH
776 过 程 工 程 学 报 第7卷
表1 自由酶和固定化酶的pH 稳定性
Table 1 Residual activity of free lipase and immobilized
lipase under different pH values (%)
pH Free lipase Immobilized lipase 6.0 6.25 33.33 7.0 12.55 57.58 8.0 68.13 88.79 9.0 18.70 48.48
3.3.2 温度对酶活性及稳定性的影响
由图7可见，固定化酶的最适温度比游离酶提高了5.℃ 温度范围在25∼40℃时，游离酶酶活变化较小，而固定化酶酶活变化较大. 可能是因为温度较低时，底物与固定化酶之间的传质受到的限制较大，而底物与游离酶之间的传质受限程度较小；温度超过40℃时，固定化酶酶活变化较游离酶小，主要是因为固定化酶比游离酶稳定，不易失活，这也可以从以下的温度稳定性实验中得到验证.
图7 不同温度下自由酶和固定化酶的活力
Fig.7 Effect of temperature on the activities of free lipase and
immobilized lipase
平行称取游离酶和固定化酶各3份，分别在35, 40, 45℃下保育1 h 后测酶活，与无保育的游离酶和固定化酶比较，结果如表 2. 在各温度点，固定化酶酶活剩余都比游离酶的高，说明固定化后，酶的温度稳定性有了很大的提高.
表2 自由酶和固定化酶的温度稳定性
Table 2 Residual activity of lipase and immobilized lipase
under different temperatures (%)
Temperature (℃)Free lipase Immobilized lipase 35 55 84.58 40 17.5 52.69 45 5 30.11
3.3.3 固定化酶活性的比较
在酶粉与载体质量比为1:1、温度25℃、固定化时间1 h 及pH 8.0的条件下进行酶固定化，所得酶活为464 U/g. 自制载体的孔径主要分布于150∼400 nm ，并且有
超大孔存在. 文献[1]中所用的酶种与本研究的完全相同，所用载体为NKA 树脂，孔径主要分布于20∼22 nm ，固定化酶水解酶活为156 U/g. 可见大孔载体具有一定的优势.
3.3.4 固定化酶的操作稳定性和储藏稳定性
为了验证本实验固定化假丝酵母脂肪酶的效果，考察了固定化酶催化十二酸与正辛醇在正己烷中反应合成十二酸辛酯的情况，结果如图8所示. 可以看出，本实验制备的载体固定化脂肪酶能够较好地催化十二酸辛酯的合成反应，间歇反应20批十二酸的转化率仍可达60%(每批反应80 min). 另外，固定化酶在4℃冰箱中保存7 d ，酶活仍剩余94%，而自由酶的酶活只有85%.
图8 固定化脂肪酶的操作稳定性
Fig.8 The operational stability of immobilized lipase
4 结 论
本研究以固液联合致孔方式自制的大孔载体成功地固定化了解脂假丝酵母脂肪酶. 大孔结构的存在使固定化在很短的时间内完成，减小了固定化过程的酶活损失. 对固定化条件进行优化，得到了温度20∼25℃、固定化时间1.5 h 、酶粉与载体质量比为1:1的最佳固定化条件. 固定化酶的热稳定性、pH 稳定性、储藏稳定性均比游离酶有了明显的提高，其操作稳定性好，间歇催化月桂酸辛酯合成反应20批，仍保持有较高的活力.
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20
30
4050
60
020004000600080001000012000
140000
100200300
400 A c t i v i t y o f f r e e l i p a s e (U /g )
Tempreture (℃) A c t i v i t y o f i m m o b i l i z e d l i p a s e (U /g )
04812162060708090
100
C o n v e r s i o n r a t e (%)
Batch
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Investigation of Immobilized Lipase onto Macroporous Carrier
CAI Hong-ju, FU Da-yan, WANG Man-yi, ZHOU Xin, TAN Tian-wei
(Key Lab. of Bioprocess of Beijing, Collage of Life Sci. & Technol., Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China) Abstract: Immobilization of lipase on macroporous poly(glycidyl methacrylate-co-divinylbenzene) was investigated and followed by the optimization of immobilizing conditions. The optimized results were achieved with the 1:1 mass ratio of lipase to the carrier, coupling temperature between 20∼25, and immobilizing time
℃ of 1.5 h. The optimum pH and temperature of immobilized lipase were 8.5 and 40, respectively.
℃The activity of immobilized lipase remained 94% of the origin after storage at 4 for 7 d.
℃The experimental results showed that the thermal stability and operational stability were improved in comparison with free lipase.
Key words: macroporous carrier; lipase; immobilized lipase。