大孔载体固定化脂肪酶

2007年 8 月 The Chinese Journal of Process Engineering Aug. 2007

收稿日期：2006−11−02，修回日期：2006−12−25

基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：20636010; 50373003)；国家杰出青年基金资助项目(编号：20325622)；北京市科技计划基金资助项目(编号：

D0205004040211)

作者简介：蔡宏举(1976−)，男，辽宁省铁岭县人，硕士研究生，生物化工专业；谭天伟，通讯联系人，E-mail: twtan@.

大孔载体固定化脂肪酶

蔡宏举， 付大雁， 王满意， 周 鑫， 谭天伟

(北京化工大学生命科学与技术学院，北京市生物加工过程重点实验室，北京 100029)

摘 要：用自制大孔载体固定化脂肪酶，对固定化条件进行了优化，比较了固定化酶与游离酶的酶学参数. 结果表明，酶粉与载体质量比为1:1、固定化温度在20∼25℃之间、固定化时间1.5 h 的条件下，所得固定化酶的酶活最高. 固定化酶的最适pH 为8.5，最适温度为40℃，其热稳定性、操作稳定性都比游离酶高，4℃下保存7 d 后，酶活仍剩余94%.

关键词：大孔载体；脂肪酶；固定化酶

中图分类号：Q814.2 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2007)04−0773−05

1 前 言

脂肪酶(EC3.1.1.3)是一类特殊的酰基水解酶，能够在油−水界面催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、多肽合成等反应，在制药、试剂、食品加工、生物能源等方面有着很大的应用潜力[1,2]. 由于游离酶不易回收，很难重复利用，限制了其大规模应用. 因此脂肪酶催化技术的应用在一定程度上取决于固定化技术. 目前固定化载体的研究主要集中在多孔粉体材料[3]，如介孔材料MCF [4], MCM-41[5]等. Pandya 等[6]发现，孔径较大的MCF(15.3 nm)的酶固定化比孔径小的MCM-41(2.6 nm)效果好. 这是因为酶更易被固定在孔径较大的孔内，提高了单位载体上酶的固载量，因而提高了单位酶活. 黄磊等[7]以微孔陶瓷载体固定化脂肪酶，仅对部分改性条件优化的情况下，固定化酶活就已经与高贵等[8]用无孔硅藻土固定化脂肪酶的酶活相当. 但脂肪酶是大分子，如果载体孔径小，将会影响固定化过程中酶与载体内部的传质，也会影响固定化酶催化反应时底物与脂肪酶间的传质过程. 如果在固定化介质中增加大孔分布，则可以提高固定化过程的速度，提高底物与酶之间的传质速度，提高反应效率. 从以上分析可知，大孔径固定化酶载体材料更有优势，但目前这方面的研究较少.

本工作以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体，二乙烯基苯(DVB)为聚合交联剂，采用固液联合致孔方式，通过本体聚合制备了具有大孔结构的含环氧基的多孔载体. 载体上的环氧基团水解成羟基后，以戊二醛为偶联剂[9]，用载体偶联法固定化假丝酵母脂肪酶. 比较了固定化酶和游离酶的最适温度、pH 值及稳定性等参数.

2 实 验

2.1 材料和仪器

假丝酵母(Candida sp. 99-125)脂肪酶，酶活约13000 U/g ，实验室自产；甲基丙烯酸缩水甘油酯，纯度大于96%，美国ACROS 公司；二乙烯基苯(含量56%，用5%的NaOH 预处理，洗去阻聚剂等杂质)，淄博嘉龙化工科技有限公司；纳米碳酸钙(粒径小于80 nm)，广东嘉维化工实业有限公司；其他试剂均为分析纯.

StereoScan-250-MK3扫描电镜, Cambridge; Porosimeter PASCAL 140&240压汞仪，Thermo Electron Corp., USA ；Multyskan Spectrum 酶标仪，Thermo Labsystems ；GC-2010气相色谱，日本岛津公司. 2.2 实验方法 2.2.1 载体的制备

量取甲基丙烯酸缩水甘油酯5 mL ，二乙烯基苯2 mL ，甲苯和正庚烷各3.5 mL ，称取7 g 纳米碳酸钙，与上述液体一起放于50 mL 的三角瓶中，反复超声混合后，置于65℃超级恒温水浴中反应12 h. 所得固体经粉碎后，筛分收集0.335∼0.45 mm 粒径的颗粒，用乙醇抽提24 h ，然后用适量的0.1 mol/L HCl 于常温、搅拌状态下浸泡72 h ，并且每隔24 h 换1次HCl ，以除去碳酸钙，最后用去离子水冲洗至中性，密封湿态保存. 2.2.2 载体的活化

称取0.4 g 载体，65℃下用0.1 mol/L HCl 水解12 h. 用去离子水冲清洗至中性，加入10%的戊二醛酸性溶液25 mL ，室温下振荡反应12 h ，用去离子水洗去戊二醛，所得载体放于冰箱中保存.

2.2.3 固定化酶的制备

称取一定量酶粉，用pH 8.0的0.1 mol/L 磷酸缓冲液配成10 mg/mL 的酶溶液. 向装有0.1 g 载体的三角瓶中加入15 mL 配好的酶液，室温下在摇床中反应一定时间，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗固定化酶载体，直到洗液中不含蛋白质为止. 所得固定化酶放于4℃冰箱中保存.

2.2.4 脂肪酶含量的测定

脂肪酶含量的测定按照Bradford 的方法[10]进行，以牛血清白蛋白为标准.

2.2.5 游离酶和固定化酶水解活力的测定

均采用橄榄油水解法[11]. 40℃下，

1 min 水解底物产生1 µmol 脂肪酸为1个活力单位. 酶活回收率计算：

酶活回收率=固定化酶总活力/(加入酶液总活力−残液总酶活力).

2.2.6 脂肪酶催化十二酸与正辛醇反应合成十二酸辛酯

在50 mL 锥形瓶中加入9.5 mL 正己烷，0.2 g 十二酸和316 µL 正辛醇，同时加入0.2 g 固定化酶，0.4 g 变色硅胶以吸收反应产生的水. 反应在温度40℃、转速150 r/min 的摇床中进行. 2.2.7 酯合成转化率的测定

按照文献[1]的方法进行.

3 结果和讨论

3.1 载体孔结构的表征

实验制备的载体的扫描电镜照片见图1. 载体的液体致孔剂为甲苯和正庚烷(体积比为1:1)，浓度为100% (与反应组分GMA 和DVB 体积总和比为1:1)，加入的固体致孔剂CaCO 3的质量与整个液相(GMA, DVB 和液体致孔剂)的体积比为1:2，载体的交联度为40%(DVB 与GMA 体积比).

从SEM 照片可以看出载体的孔结构. 载体不仅具有微孔和大孔结构分布，还具有约2 µm 的贯通式超大孔. 这是固液联合致孔的特点(生成双孔结构)，液体致孔剂主要生成微孔，固体致孔剂与反应相不溶，并且部分颗粒因为表面自由能大而形成团聚，导致介质形成大孔和超大孔结构.

利用压汞法测定了载体的孔径(D )分布，如图2所示. 可以看出载体的孔径分布集中在2个区域，为典型的双孔分布，这与扫描电镜的结果一致. 从压汞法数据可知，载体150∼400 nm 的孔占总孔容积(V )的60%，直径2∼8 µm 的孔占总孔容积的14.9%，其他孔占总孔容积的25.1%，总孔隙率为59.82%，总孔容积为1.24 mL/g ，比表面积29.6 m 2/g.

图1 自制大孔载体的扫描电镜照片

Fig.1 SEM photographs of the carrier

图2 自制大孔载体的孔径分布

Fig.2 Pore size distribution of carrier

3.2 固定化条件的优化 3.2.1 酶用量的确定

在固定化酶时，平行称取0.1 g 载体6份，分别加入不同体积的10 mg/mL 酶液，并加入一定体积的缓冲液调整酶液体积到15 mL ，在室温下放入摇床中固定化1.5 h. 实验结果如图3所示.

单位质量载体能够固定的酶是有限的，当载体固定

的酶达到一定量后，继续加大酶量不会提高固定化效果. 从图3可见，当加入的脂肪酶质量增大到0.1 g ，即酶质量与载体质量比为1:1时，固定化酶的活力回收率达到最大值，再增大酶量，酶活开始趋于不变，固定化酶的

100

1000

10000

1

23d V /d (l o g D )

Pore diameter (nm)