酵母人工染色体

2009-08-04 22:22

人类人工染色体HAC

人类人工染色体研究进展

人类人工染色体研究进展

摘要：本文主要介绍了人类人工染色体（HAC）的结构、构建及其在基因治疗、转基因动物等方面的应用，对HAC的最新研究进展作了简要介绍，同时总结了当前HAC研究面临的问题。

关键词：HAC 基因治疗转基因动物

酵母人工染色体（YAC）[1,2]、细菌人工染色体(BAC)等人工染色体相继构建成功以后，1997年，科学家成功构建了第一条人类人工染色体（Human Artificial Chromosome，HAC）[3]。与YAC、BAC等相比，HAC不整合到细胞的基因组中,而是以一个独立的功能性染色体单位而存在，可以同细胞中正常的染色体一样复制、分裂、稳定遗传，并且不会对受体产生毒害，这使得HAC有可能解决基因治疗中的一些难题[3,4]。HAC具有容量大、不容易导致基因沉默、可随细胞周期表达或关闭等优点，开创了人工染色体研究的新纪元，其研究受到广泛关注。

1. HAC的基本结构

HAC包含构成人工染色体的所有基本结构，即端粒（TEL）、复制起点（Origin）及着丝粒（CEN）。

1.1 端粒

端粒是人工染色体中了解得比较清楚的一个基本功能单位。端粒是DNA-蛋白质复合物，能阻止染色体末端相互连接，并防止染色体复制时DNA丢失[5]。端粒DNA由长5-20kb的(TTAGGG)n重复的排列串组成；将长度超过1 kb的(TTAGGG)n重复序列导入体外培养的人类细胞后,可在70%的转染细胞中发挥端粒功能[6]。Farr将克隆的端粒DNA导入人-鼠杂种细胞，证明端粒DNA可以形成具有完整功能的端粒[7 ]。

1.2 复制起点

人基因组DNA中约每50-300kb为一个复制子，每个复制子有一个独立的复制起始点以启动DNA合成[8]。一些基因位点的复制起始点已被定位，如β-球蛋白基因、二氢叶酸还原酶基因等，但将这些位点的DNA片段转入细胞后就失去了复制起始点的功能。现在仍不知一个复制起始点到底需要多大，因为当DNA片段太短时则不具有复制起始点的功能[8,9]。也不知道构造哺乳动物人工染色体时是否要求特定的复制起点序列。

1.3 着丝粒

目前还不知道着丝粒的精确的DNA序列，具有着丝粒功能的DNA序列又难以在体外进行操作[10]，因此，着丝粒结构成为当前HAC研究中的一大难点和热点。人类染色体上具具有一段171bp的α-卫星DNA重复序列[11]，是人类着丝粒的主要组成元件，该序列单体可以不同方式排列成几Mb的片段[12]。由于人类染色体均含有一定数量的α-卫星DNA[11]，而且大多数人类染色体α-卫星DNA均具有着丝粒功能[13],因此可以认为，着丝粒功能是以这种重复序列为结构基础的。用含70 kb 21号染色体α-卫星DNA序列的DNA或1个85 kb含X 染色体来源的α-卫星DNA序列的结构进行转染，可以有效地形成HACs，这进一步证实了α-卫星DNA在构造人工染色体中的重要作用。

2. HAC的构建

2.1 天然染色体改造法构建HAC

构建HAC的策略之一是以天然染色体的断裂片段为基础，构建新的HAC，如构建△HACs[14]。通过低剂量辐射、端粒定位染色体截断技术、外源性DNA片段定点插入后扩增等都可以获得天然染色体的断裂片段。这种方法通过含有端粒片段和选择标记、有时也通过含有靶染色体同源片段的打靶载体将特定染色体连续截为更小的微型染色体，所获得的微型染色体是自由的，也是可以正常分离的[15]。图1显示△HAC的构建方法及外源基因导入方法。△HACs是通过对人21号染色体的长臂（q arm）和短臂（p arm）进行部分序列切除而构建成[14]，通过cre-重组酶介导的Cre/loxP系统插入待转移的目的基因。

图 1 The △HAC system[14]. (a) Generation of the 21DpqHAC vector. (b) Loading of transgene to the 21△pqHAC vector.

2.2 组装法构建HAC

这种方法可以称为组装法或从下到上法，即通过将已成功克隆的着丝粒和端粒DNA导入人类培养细胞来形成从头构造的HACs，所获HACs的长度为1-10 Mb。利用此方法Harrington 等在HT1080细胞中得到了第一个HAC[3]. 他们将大于1 Mb的人17号染色体的α-卫星DNA、人端粒DNA、人基因组DNA随机片段用脂质体共转染HT1080细胞,。经过重组，那些同时含有着丝粒、端粒、复制起点且按照正常染色体结构顺序的重组连接产物以染色体的形式稳定保存下来，而那些不完整或未按照正常顺序连接的产物因其不能稳定地进行有丝分裂而丢失、降解。由此通过有丝分裂而自然筛选出HAC[16,17]。其他研究者利用HT1080细胞导入含有人α-卫星序列结构的环状YAC、PAC或BAC结构和端粒序列，这些细胞中产生了从头构造的环状人工染色体[18]。

3. HAC载体表达体系

目前，目的基因的插入主要基于如下几种策略:(1)共转染；(2)应用Cre/loxP和FLP-FRT系统进行位点特异性重组；(3)染色体克隆技术[14,19,20]。Kuroiwa等[20]将Cre/LoxP介导的位点特异性重组技术同端粒定位染色体截断技术相结合,发展了染色体克隆技术(图2),使精确地插入特定染色体区段成为可能。Auriche等将囊性纤维化跨膜转导调节因子基因(CFTR)全序列及其上游调控序列插入HAC中，成功地检测到了该基因的转录和翻译产物[21]。Ikeno 等[22]将携带三磷酸鸟苷酸环化水解酶基因(GCH1)全序列(包括编码序列和调控区)的BAC,与包含α-卫星DNA序列的BAC共转染，进入人类成纤维细胞内，筛选出携带GCH1基因的HAC克隆，分析结果表明，这些HAC表现出很高的有丝分裂稳定性，且GCH1水平明显提高，并对IFN-γ的刺激高度敏感。

图2 染色体克隆技术

4. HAC的应用

4.1 基因治疗

过去的基因治疗方案中，所用载体在转染宿主细胞后,目的基因可能会出现不表达，或通过非同源重组而插入宿主细胞染色体，造成宿主细胞的癌化等结果，这严重影响了基因治疗的效果[23]。而HACs 作为载体则可以避免对宿主细胞染色体的负面影响，并由于其具有携带大片段基因的优点，可以将目的基因调控序列一并导入细胞内，从而实现目的基因时空特异性的表达，大大提高了基因治疗的有效性和安全性,显示出了良好的应用前景。人类人工染色体可以作为表达载体，通过在人类细胞中表达目的蛋白以修补有缺陷的基因，从而可以