流感病毒分子生物学研究进展

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流感病毒分子生物学研究进展

中日友好医院(100029)　安　菁　林江涛　

流感病毒是研究最早的病毒之一,主要原因与流感的严重危害有关。流感发作快、传播迅速,短时间内可造成局部地区的爆发或全球范围的流行,导致灾难性的后果。从19世纪以来,已出现四次全球性的流感大流行,最严重的一次(1918～1919年)全世界死于流感的人数超过20万。几十年来,人们作了大量的工作,试图运用分子生物学的手段从机理上揭示流感病毒感染性与致病机制,以研究有效的防治(如监测、疫苗)手段。

1　流感病毒的基因组结构

流感病毒属于正粘病毒科,是RNA病毒。依据其核蛋白(NP)抗原性的差异分成A、B、C三型,这三个型分别在基因组结构、多肽组成、感染性和致病性等方面存在差异。

流感病毒为有包膜的病毒,包膜分内、外两层。内层包膜由基质蛋白M1构成,M1在颗粒核蛋白体(vRNP)的胞质、胞核间的有序转移及病毒体的成熟过程中具有重要的调节作用。外层包膜由一脂质双层构成,其上面嵌有三种病毒蛋白:具有血凝素活性的蛋白质H A、具有神经氨酸酶活性的蛋白质NA和基质蛋白M2。包膜内为病毒基因组与病毒RNA聚合酶亚单位P B1、P B2、PA以及NP形成的具有特定空间构象的结构,称为vRNP,具有依赖RNA的RNA 聚合酶活性。

流感病毒基因组由7个(C型病毒)或8个(A、B 型)分节段的单股负链RNA构成,每个RNA节段的两端都有相对保守的非编码序列,如5′端存在13个核苷酸,3′端存在12个核苷酸,且5′端与3′端反向互补形成锅柄结构。这些结构参与病毒vRNA的复制和mRNA的转录,在RNA聚合酶结合活性、启动子活性、poly(A)化作用以及激活核酸内切酶活性中具有重要作用,是流感病毒复制、转录、包装的重要调控成分。每个RNA节段包括至少一个开放阅读框架(ORF),如:A型流感病毒的各RNA节段及其编码的病毒蛋白为RNA1-P B2、RNA2-P B1、RNA32PA、RNA4-H A、RNA5-NP、RNA6-NA、RNA7-M1和M2、RNA32PA、RNA8-NS1和NS2等。

2　流感病毒的复制及调控

流感病毒大多在宿主细胞核中复制其基因组,通过质膜或细胞器膜芽生形成成熟的病毒颗粒。流感病毒基因组为负链RNA,与具有活性的转录酶复合物和其他负链RNA病毒相同,vRNA、cDNA和cD2 NA转录形成的RNA均不具有感染性,只有形成RNP并转染宿主细胞后才能在宿主细胞内起始病毒基因的复制和表达。

流感病毒侵入宿主细胞依赖于H A的凝集素位点与宿主细胞表面的唾液酸的结合。H A介导病毒包膜与内体膜的融合,使病毒壳衣壳释放进入胞质。流感病毒的脱壳与内体的低pH环境引发的病毒核衣壳结构改变有关,但低pH诱导核衣壳结构改变的分子机制尚不清楚。当病毒脱壳,vRNP在ATP供能的条件下,很快通过宿主细胞核孔复合物(NPC)向核内转运。vRNP向宿主细胞核内转运的调控与NP 和胞质因子NPI21、核转运受体、Ran(T C4)及P10 (NTF2)有关。只有当vRNA与NP同时存在时,vRNA 才可转运到细胞核内。流感病毒蛋白的合成分两个时项。NP、RNA聚合酶亚基和NS1在感染后最初2～3小时即生成。其他蛋白质如H A、NAM1、M2和NS2合成较晚。病毒蛋白的合成可能受到病毒mR2 NA向核外运输的调节,并可能与病毒蛋白NS1的功能有关。对病毒蛋白合成时间的控制在病毒感染周期中具有重要作用,与病毒核衣壳的组装、vRNP的成熟和释放等相关。流感病毒在特定时间内合成的蛋白成分均要通过宿主细胞的介导进入核内以完成vRNP的组装。构成vRNP的主要蛋白成分是NP,为子代vRNA的合成所必需,在RNA复制的同时,子代vRNA随即与NP形成具高级结构的子代vRNP。病

毒vRNP合成后3小时,vRNP开始通过NPC由核内向胞质转移,持续数小时。M1是vRNP向核外转运的动力。只有在细胞中合成M1,并且进入核后才发生vRNP的核外转运。

3　反向遗传操作和流感病毒载体的改造与应用1989年由Luyties等人将外源性RNA分子导入流感病毒颗粒的基因组中,首创了流感病毒以及其他负链RNA病毒分子生物学研究的反向遗传操作方法。具体而言,他们将报告基因C AT的反义与流感RNA病毒A/PR/8/34毒株基因组3′和5′端的非编码区相连。在体外,纯化的流感病毒RNA聚合酶可实现C AT负链RNA的转录。将C AT和RNA与流感病毒RNA聚合酶复合物在体外组建RNP。将其转染宿主细胞M DCK,C AT的RNA在细胞内复制、转录和表达,并形成含有C AT的RNA的嵌合子代病毒。

流感病毒反向遗传操作方法的建立使得流感病毒可被改造成表达外源基因的病毒载体。利用RNP 转染系统,结合外源基因和宿主细胞的辅助功能,可确定不同的筛选方法以获得具有目的基因的转染子代病毒。

RNP转染系统和筛选方法的建立和完善使外源基因的表达成为可能。以流感病毒为载体,表达抗原表位,可激发宿主的主动免疫,已应用于预防接种工程中。流感病毒主要侵染人呼吸道上皮细胞,在激发机体局部粘膜免疫方面有重要作用。可利用这一特点,以流感病毒作为载体,将其他病原体的重要宿主保护性抗原的主要表位呈递给宿主免疫系统,激发宿主的主动免疫。H A是流感病毒的主要免疫原,其中的抗原表位包括A、B、C、D、E五个结构域。将其他病原体的抗原表位取代H A的结构域,可获得转染体流感病毒,如:含有疟原虫的环孢子蛋白(CS蛋白)的转染体流感病毒,含有HI V-1的gp120的转染体流感病毒等。重组流感病毒转染体可激发人体产生对相应嵌合病原体的主动免疫。

4　流感病毒分子流行病学

19世纪全球共出现四次流感大流行。第一次发生于1918～1919年,称为“西班牙流感”(S panish In fluenza)。它造成灾难性的后果,全球有二千万以上的人死亡,主要分布在年青人中。感染来自鸟类的A型流感病毒H1N1亚型,1910～1920年通过猪传染人类。第二次发生于1957年,称为“亚洲流感”(Asian In fluenza)。最早出现于中国贵州,迅速传播全世界。感染来自A型流感病毒H2N2亚型(也称甲2亚型)。这一亚型为人以禽流感病毒通过基因重配而来,因其H A、NA、P BI三个基因片段来源于鸟流感病毒,其余的基因片段来自当时人群的流感病毒。第三次发生于1968年,称为“香港流感”(H ong K ong In fluenza)。最早出现于中国香港,后传播到日本、美国等地。感染来自A型流感病毒H3N2亚型(也称甲3亚型)。这一亚型同样认为是人以禽流感病毒通过基因重配而来,因其H A、P BI基因来源于鸟流感病毒,其余的基因节段来自当时人群的流感病毒。第四次发生于1977年,称为“俄国流感”(Rus2 sian In fluenza)。最早出现于中国东北和华北地区,传播较慢,主要侵袭年青人和家禽。感染来自A型流感病毒H3N2亚型流行基础上H1N1亚型的重视。

流感病毒的分子结构和宿主界限有利于流感病毒的复发发作和疾病的流行。从分子结构上看,流感病毒分A、B、C三型,A型流感病毒又分许多亚型,至今H A有15个亚型,NA有9个亚型。流感病毒的基因组分节段,易发生基因重配,即不同来源的流感病毒基因节段包被在一起形成新的毒粒。流感病毒的基因突变率很高,尤其H A、NA基因极易发生点突变,导致其编码的蛋白质氨基酸序列的改变,从而逃避宿主的免疫系统的识别和清除,此外H A蛋白分子上个别关键氨基酸位点的突变,尤其是受体结合部位的氨基酸发生替换,就有可能造成毒粒致病性和传播能力的改变。流感病毒的宿主界限表现为不同宿主中流感病毒亚型的分布不同。在自然界中,流感病毒的宿主范围相当广,有鸟类及哺乳类。鸟类中存在所有的H A、NA亚型。猪中为H1N1和H3N2亚型及C型流感病毒,人群出现H1～H3,N1～N2的亚型组合,H5N1亚型和B型流感病毒。由于在不同宿主体内流感病毒所受的选择压力不同,其进化速率有相当大差异。鸟类流感病毒相当保守,而人类流感病毒则进化较快,尤其是控制表明糖蛋白的基因H A、NA因受到宿主免疫系统的选择压力,其进化速度要比其他基因快得多。

5　流感灭活疫苗的研究和使用

至今为止,感染人类的流感病毒有H1N1、H2N2、H3N2、H5N1亚型的A型流感病毒和B型流感病毒。比较活跃的有H3N2、H1N1亚型的A型流感病毒、B型流感病毒和1997年5月出现的H5N1亚