昆虫病毒空斑分析

5.1 4%低熔点琼脂糖培养基的配制
5.1.1 微波炉加热或者70℃水浴,溶化4%低熔点琼脂(PBS溶解)。

当低熔点琼脂溶化后，将下列物品放入水浴中：
空的100ml无菌瓶
Sf-900II培养基
5.1.2 待低熔点琼脂溶化后，马上将低熔点琼脂、无菌瓶及Sf-900II培养基放入超净台。

5.1.3 将30ml Sf-900II培养基及10ml 4%低熔点琼脂放入100ml无菌瓶中，温和混匀。

5.1.4 准备好后，于40℃保存。

5.2 蚀斑试验
5.2.1在转染当天，收获sf9细胞，并准备30ml细胞悬液，调整细胞密度为6×105细胞，于6孔板中每孔铺2ml细胞。

5.2.2 室温放置1hr，让细胞贴壁。

5.2.3 1hr后，用倒置显微镜观察细胞贴壁的状态，汇合度50%细胞贴壁。

5.2.4 在sf-900II SFM中将病毒稀释8个浓度梯度（10-1—10-8）。

取0.2ml病毒放入1.8ml培养基中，稀释为10-1，然后从10-1浓度的病毒中取0.2ml病毒放入1.8ml培养基中，稀释为10-2，依此类推。

5.2.5 将6孔板中的培养基移去，马上加入1ml病毒稀释液。

5.2.6 培养1hr后，马上将40℃水浴的平板培养基放入超净台。

5.2.7 将病毒液取出，马上将2ml的平板培养基放入。

（动作要快，以免培养基凝固）。

5.2.8 室温放置10-20min。

5.2.9 将培养基放于27℃，5%CO2培养箱中培养。

5.2.10 在感染第四天时，用sf-900II SFM培养基配制1mg/ml的中性红溶液，抽滤除菌。

5.2.11 将1.5ml的1mg/ml的中性红溶液加入1
6.5ml的sf-900II SFM培养基中配制中性红溶液，混匀，然后放入40℃水浴中。

5.2.12 将4%的低熔点琼脂溶解，放入40℃水浴中，5min。

5.2.13取6ml 4%的低熔点琼脂加入中性红溶液中，40℃水浴保存。

5.2.14 迅速将配好的低熔点琼脂中性红溶液，按每孔1ml，加入6孔平板培养基中。

5.2.15 待凝固后，于27℃，5%CO2培养箱中继续培养3-6天。

5.2.16 在转染后第7-10天时，用细胞培养级别的水配制1mg/ml的中性红溶液2。

5.2.17 每孔加入0.5ml的1mg/ml的中性红溶液2，室温培养1-2hr。

5.2.18 小心用移液器取出多余的染液，计数。

一般情况下，从杆状病毒中获得的病毒滴度为：
P1：1×106----1×107
P2：1×107----1×108。