代谢控制发酵考卷

6. Metabolic interlock（3分）

代谢互锁：

B C D

A E F

G H I

X Y

分支途径上游的某个酶G——H受到另一条分支途径的终产物，甚至与本分支途径几乎不相关的代谢中间代谢的抑制或激活。使酶的活力受到调节。

7. Analogue-- resistance mutant（4分）

抗代谢类似物的突变株：通过诱导等手段获得突变株，已解除了终产物对酶的反馈调节，也就是说终产物A不再与调节酶的调节部位或阻遏蛋白结合。那么A的结构类似物A1也同样不再与调节酶的调节部位或胞质阻遏蛋白结合，也就是A1对菌株的毒害作用表现不出来，我们就说该菌株对A1有抗性（resistance），此菌株即成为抗代谢类似物的突变株。

二、填空（10分）每空白点2.5分

在下列营养条件下填写E.coli的乳糖糖操纵子的表达方式：

1、当无葡萄糖、细胞cAMP水平低、又无乳糖糖糖时，不生长

2、当无葡萄糖、细胞cAMP水平高、有乳糖糖糖时，大量表达

3、当有葡萄糖、细胞cAMP水平低、又无乳糖糖时，不表达

4、当有葡萄糖、细胞cAMP水平高、有乳糖糖时，少量表达

四、请论述和回答（40分）

1．请总结黑曲霉柠檬酸产生菌的柠檬酸发酵机制（15分）

葡萄糖发酵生成柠檬酸的理想途径是：1mol的葡萄糖经糖酵解途径转变为二摩尔丙酮酸，其中1mol丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶（PDH）脱氢脱CO2生成乙酰辅酶A，另一摩尔丙酮酸在丙酮酸羧化酶（PC）的CO2固定反应生成草酰乙酸，进而生成苹果酸；乙酰辅酶A与苹果酸进入线粒体内，苹果酸再生成草酰乙酸，通过线粒体内的柠檬酸合成酶（CS）的缩合作用下，生成柠檬酸。

C6H12O6 + 1.5O2→C6H8O7 + 2H2O

在碳平衡方面没有碳原子的损失，在乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合时还从水中引进一个氧原子，对糖的转化率为106.7%

黑曲霉柠檬酸产生菌积累和生成柠檬酸的发酵机制主要有：

①由于严格限制供给锰离子（激活剂），从而解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径的代谢流增大。（Mn2+↓→HMP↓→合成蛋白(核酸)↓→NH4+↑→PFK↑→柠檬酸）；

②存在一条呼吸性强的侧系呼吸链，对氧敏感，但不产生A TP，这样使细胞内A TP浓度下降，促使EMP途径的畅通，增加柠檬酸的生物合成；

③丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和草酸乙酸的供给，柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成能力；

④α-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖（蔗糖）和铵离子阻遏，使黑曲霉中的TCA 循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TCA循环降低细胞内ATP浓度，另使α-酮戊二酸浓度升高，反过来反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解；

⑤顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=9：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，而柠檬酸分解活力低，一旦柠檬酸浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶的活力，从而进一步促使柠檬酸的自身积累，PH降至2.0以下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累并排出体外。

○5用乙酰CoA激活PC酶（因为乙酰CoA与Asp之间存在平衡合成）

○6采用低糖（4-5%）添加方法可激活PC酶

（4）设法增加（强化）Glu的反馈控制，使Glu优先合成

4.切断苏氨酸进一步代谢的途径

由于细胞可以苏氨酸为前体进一步合成异亮氨酸，这就必然会导致苏氨酸积累量减少，为避免苏氨酸被菌体利用，还需要切断苏氨酸进一步代谢的途径，即选育Ile-或Ile L突变株或者异亮氨酸缺陷的回复突变株、

5.选育温度敏感突变株，

以乳糖发酵短杆菌等谷氨酸产生菌为出发菌株，30℃下250μg /mLMNNG诱变处理30分钟，分离选育30℃下生长良好，而在34℃不能生长的温度敏感突变株5.Lys生产菌株的定向选育标记

以谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、北京棒杆菌、钝齿棒杆菌等Glu生产菌株为出发菌，通过诱变定向选育获得遗传标记应为：DAP- ＋Lys-＋ A1a-+AEC R+CCL R+ CBL R+AspHx R+Ile-+Met-+tem s

（四）采用细胞融合和重组DNA技术选育高产Thr菌株。

（五）发酵条件控制为：发酵温度为32～35℃，pH为6.5,充分供氧气。

2009 -2010学年第 1学期本科试卷

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