乳酸乳球菌电转化条件的研究

学
报
（ 理
学
版）
第４ ０卷
固定电阻为４０ ０ Ｓ 电容为２ｔ ， ２ ， ５ 改变电场强度 Ａ Ｆ
１ 材料与方法
１１ 菌株与质粒 ． 乳酸乳球菌（ａ ｏ ｃ ｓ ｉ Ｍ １１， Ｌｃｃ ｃ ｌ ｔ） ６４ 为本实 ｔｏ ｕ ａ ｓ ｃ Ｇ
验室保藏 ．
进行电转化 ． 电场强度对转化效率的影响结果如图
乳酸乳球菌（ａｔ Ｌｃ
ｌ ｔ） ａ ｉ 是乳品工业发酵 ｃｓ
化法和电转化法两种． 原生质体转化法存在耗时长、
的重要菌种〔， ‘ 也是腌制蔬菜、 〕 肉制品的常用菌 种【， ’ 在食品加工中有着重要的作用． 〕 因此， 乳酸乳
球菌成为基因工程研究的模式菌株 ． 人们利用 Ｄ Ａ Ｎ 重组技术 ， 使其携带外源基因并表达外源基因产物，
６
。 ［ 认 ｕ口 。叫 。嗯
２ ０ ４
。日 。
ｒ ｎ ／ 山盛
图 ５ 复苏时间对电转化效率的影响
６ ． ６５ ．７ ７５ ． Ｓ
Ｆ ． Ｅ ｅｔ ｎ ｂｔｎ ｏ ｒ ｓ ｒａｏ ｅ ｃ ｎｙ ｆｃ ｏ ｉ ｕａｏ ｔ ｅ ｔｎｆｍ ｔｎ ｉｅｃ ｉ ５ ｆ ｆ ｉ ｉ ｎ ｏ ｉ ｆ ｉ ｇ ｃ ｍ ａ ｆ
Ｍ７ ： 国 Ｏｏ 公 司生产 ； Ｍ １ 培养基 英 ｘｉ ｄ Ｇ１ ７培养 基： １ ＋ ．％葡萄糖 ；Ｇ １ 培养基 ： ｍ Ｍ ７ Ｍ ７ ０５ Ｓ Ｍ ７ １ Ｌ ＋ ０ １
１ ｔ ５％蔗糖 ＋２ ｐ ５％ 葡 萄 糖 十 ５ ｔ ０ ２ Ｌ ６ ０ ． ０ ０ Ｌ
双尹 ０
Ｇ １平板， Ｍ ７ 培养 ３ － ８ ， ６ ４ ｈ计数转化子， 根据质粒 Ｄ Ａ的浓度， Ｎ 计算每１ Ｄ Ａ ｉ Ｎ 所得的转化子个数， ． ｇ 即
为转化效率 ． 每项条件优化做 ３ 次重复实验 ．
图 ２ 电阻对电转化效率的影响 ｆ ｔ ｅｓ ｃ ｏ ｒ ｓｒ ｔｎ ｉｅ ｙ Ｆ ． ｆｃｏｒ ｉ ｎｅ ｔｎｏ ａｏ ｅｉｉ ｃ ｉ ２ ｅ ｆ ｔ ｇ Ｅ ｓ ａ ｎ ｆｍ ｉ ｆｃ ｎ ａ ｆ
第４卷 ０
Ｖ １４ ． ０ ｏ
第３ 期
Ｎ ３ ｏ．
山 东 大 学 学 报
（ 学 版） 理
２０ 年 ６ ０５ 月
Ｊｎ ２ ５ ． ０ ｕ ０
Ｊ ＵＲ ＡＬ Ｆ Ｎ ＮＧ ＮＩ Ｒ Ｉ Ｙ Ｏ Ｎ Ｏ Ｓ ＨＡ ＤＯ Ｕ ＶＥ ＳＴ
文章编号 ： ７－３２２０ ）３ １１ ４ １ １ ５ （０５０－ ２－ ６ ９ ０ ０
能进人； 如电压过高 ， 细胞会因细胞膜损伤过大而死
１４ １ 感受态细胞的制备 ．． 将 Ｌ ｌｔ Ｇ６４接种到 Ｇ １ ｉＭ １１ ． ｓ ａ ｃ Ｍ ７培养液中，
３ ０℃培养过夜后 ， ２ 以 ％接种量转接到溶液 工中，
亡， 从而导致转化效率的降低．
２２ 电阻大小对转化效率的影响 ．
由图 ５ 细胞复苏时间达到 ２ ， 可知， ｈ 才能有比
图 ３ 细胞生长时期对电转化效率的影响
Ｆ ． Ｅｆ ｔ ｅ ｇ ｗｈ ａ ｏ ｔ ｎｆ ｍ ｔｎ ｉｅｃ ｉ ３ ｆｃ ｏ ｃｌ ｒ ｔ ｐ ｓ ｎ ｓ ｒａｏ ｅ ｃ ｎｙ ｇ ｅ ｆ ｏ ｌ ｈ ｅ ｒ ｏ ｉ ｆ ｉ ａ ｆ
ｒｐｒ ｄ ｆ ｅ ｅｏ ｅ ｂ ｏ ． ｔ ｅｒ
Ｋ ｙ ｒｓＬｃ ｃ ｃ ｌ ｔ ； ｔｔｎｆｍ ｔｎ ｔｎｆｍ ｔｎ ｃ ｎｙ ｅ ｗ ｄ ： ｏ ｃ ｓ ｉ ｅ ｃ ｒ ｓ ｒａｏ ； ｓ ｒａｏ ｅｉｅｃ ｏ ａｔ ｏ ｕ ａ ｃ ｒ ａ ｏ ｉ ｒ ｏ ｉ ｆ ｉ ｃ ｌｏ ｅ ａ ｆ
ｆｍｔｎ ｉｃｇ ｓ １ １ ｒｓｒａｓ ｉＤ Ａ ｔｓｏｉ ｍ ｏ ， ｈ ｇ ｒ ｏｉｚ ｏ ａ ｅｃｎ ｏ ｕ ｔ ．ｘ ａｆｍｎ ｐ ｊ Ｎ ｗｈ ｅ ｕ ｆｔｓｗｉ ｉ ｉｅｔｎ ｉｈ ｅ ｒ ｉ ｆ ｅ ｙ ｐ ２ ｎｏ ｔ ｅ ｇ ｉ ｈ ｐｍ ａ ｒ ｈ ｓ ｈ ｐ ｔｓ ｏ ｆ ｉ ｅ ｏ Ｊｔ ｒ ｔ ｏ ｔ ｃ ｃ ｈｈ ａ ｔ ｏ ｍ
溶液 Ｉ： Ｌ ３ ｍ ５ ％ 蔗 糖 ＋１ ｍ Ｉ ４ ０ ０ Ｌ甘 油 ＋
５ ｍ ｄＨ ０． ６ ｄ ２ Ｌ
由图 １ ， 可知 在固空电阻为 ４０ 转化效率 ０ ｆ时， ｌ
随电场强度的增加而增加， 在电场强度为 １ ｋ／ ０ ｃ Ｖｍ
时达到最大 ． 之后随电场强度的增加转化效率反而
Ａ ｓ ａｔ Ｅ ｃ ｔｎｏ ａｏ ｆ ｔｓ ｅ ｆｍ ｄ ｒ ｓｒ ｍｄ Ｋ ２ Ｌｃｃ ｃ ｌｔ Ｍ １１． ｌ ｔ ｂｔ ｃ： ｔ ｒ ｓｒ ｔｎ ｏ ｗｒ ｐｒｒｅ ｔ ｔｎ ｅ ｐ ｓｉｐＲ Ｈ ｉｏ ｔｏ ｕ ａ ｉ Ｇ６４ Ｃｌｇ ｗ ｒ ｌ ｒ ａ ｆｍ ｉ ａ ｒ ｅ ｅｏ ｅｏ ｃ ｏ ｆ ｌ ａ ａ Ｔ ｎ ａ ｏ ｃ ｓ ｃ ｔ ｃ ｅ ｒ ｈ ｏ ｐａ ， ｔ ｆｌｓｅｇ ， ｓｎｅ ｉ ｕａｏ ｔ ｅ ａｅ ｔｎ ｏ ａｏ ｅｉｅｃ． ｈ ｏｔ ｕ ｆ ｔｓ ｔ ｃ ｌ ｈｓ ｅ ｃｉ ｉｄ ｎｔ ｒ ｉ ｃ ａｄ ｂｔｎ ａ ｆｃ ｒ ｓｒ ｔｎ ｃｎｙ Ｔｅ ｍ ｍ ｏ ａ ｈ ｅ ｅ ｌｒ ｅ ｔ ｈ ｅｔ ｅ ｃ ｒ ｓ ａ ｎ ｎ ｉ ｉ ｌ ｔ ｆｍ ｉ ｆ ｉ ｃ ｍ ｌ ａ ｆ ｐ ｉ ａ ｒ ｒ ｅ ｃ ｅ ｌ ｈｒ ｓｄ ｈ ｍｄｌｅ ｏｅｔｌ ｔｐａ ， ｔｐｒｉ ａ１．ｋ／ ａｄ ｎ， ｈ ｉ ｕａｏ ｔ ｅ Ｔｅ ｓ ａ ｅｅ ａｔ ｉ ｅ ｎｎａｇ ｗｈ ｓ ｅ ｃ ｏ ｔｎ ００ ｃ ｎ ４０ ２ ｌ ｎ ｂｔｎ ． ｔｎ ｖ ｔ ｔ ｄ ｘ ｅ ｐ ｉ ｒ ｏ ｈ ｅ ｌ ｒ ａｏ ｔ Ｖ ｍ ０ ｅｏ ｃ ｌ ｉ ｉ ｅ ｃ ｍ ｈｒ － ａ
液混合 ， 移人电转化杯中， 冰浴 １ ｍｎ设置 电击参 ０ ， ｉ 数， 然后将转化杯置于电击槽中电击 ． 电击完毕后立
４ ２
０
即向杯中加入％０ 的ＳＭ ｔ ｔ Ｌ Ｇ １ 培养液， ７ 冰上放置 ５
ｍｎ３ ｉ， ０℃静止培养一定时间， 涂布含有红霉素的
０ １ ０ ２ ０ ０ ４ ０ ０ ５ ０ ０ ０ ３ ０ ０
乳酸乳球菌电转化条件的研究
孙 磊， 孔文涛， 健‘ 孔
（ 山东大学 微生物技术国家重点实验室， 山东 济南 ２００） ５１ ０
摘要： 以质粒ｐＲ Ｈ 为材料， ＴＫ ２ 对乳酸乳球菌Ｍ １１进行电转化条件的研究． Ｇ６ ４ 实验结果表明， 在电转化过程中， 电
场强度、 电阻大小、 细胞生长状态和电击后菌株复苏时间均对转化效率有明显影响， 得到 了乳酸乳球 菌的最适电
收稿 日期 ： ０－ －１ ２ ４１ ３ ０ ２
研究， 建立了稳定的优化条件， 获得了可靠的较高的
电转化效率 ．
基金项 目： 山东省中青年科学家奖励基金资助项 目（ＩＳ２ ＯＢ １） 作者简介 ： 磊（９６）女 ， 孙 １７－， 硕士研究生 ， 从事微生物技术研究 ．
＊ 通讯作者
１２ ２
山 东
大
学
Ｓ Ｎ ｉＫ Ｎ Ｗｅ－ ｏ＆ Ｋ Ｎ Ｔ ｎ Ｕ Ｌ ， Ｏ Ｇ ｎｔ ｅ ａ Ｏ Ｇ ａ
（ｔｅ Ｌｂ ａｒｏＭｃ ｂ ｌ ｈｏｇ， ｎｏ Ｕｉ ，ｎ ２００ ， ｎｏｇ Ｃｉ ） ＳｔＫｙ ｏ ｔ ｉ ｉ Ｔｃｎｏ Ｓａ ｎ ｎ ． ｎ １ Ｓａ ｎ， ｎ ａ ｅ ａ ｒｏ ｆ ｒ ａ ｅ ｌｙ ｈ ｄ ｇ ｖ Ｊａ ５ ０ ｈ ｄ ｙ ｏ ｉ ｈａ
下降 ．
上述葡萄糖、 蔗糖浓度均为质量体积比． １３ 实验仪器 ．
电穿孔作用是利用瞬间高压击打细胞膜 ， 使之
电脉冲仪： 美国 Ｂ －ａ 公司生产． ｉＲｄ ｏ
１４ 实验方法［ ． ７ ｌ
形成孔洞， Ｄ Ａ分子得以进人细胞［． 使 Ｎ １ 在电击过 ８ １
程中， 如电压过低， 细胞难以极化产生孔洞，Ｎ Ｄ Ａ不
转化条件为： 对数生长中期的细胞， １ 经 ％甘氨酸处理， １ ｋ／ 在 ０ ｃ Ｖ ｍ电场强度、 ０ ４ Ｓ电阻下电转化， ０ ２ 转化后细胞在
ＳＭ Ｇ １培养液中 ７ 培养２ 后涂布选择性培养基， ｈ 转化率（ 转化子个数与Ｄ Ａ Ｎ 质量之比） 可达１ ｘ ０ 个／ ， ． １ ｌ 比优化 ２ ， ｋ ｇ
１３ ２
固定电场强度为 １ ｋ ／ ， ０ ｃ 电阻为 ４０ 电容 Ｖｍ ０ｎ ，
苏时间长短对转化效率的影响结果如图 ５ 所示 ．
为２ ｔ ， ５ 取不同生长时期的细胞进行电转化． ． Ｆ 其对
转化效率的影响结果见图 ３ ．
，哭 ・令
， ‘ ０
，哭 ・ 分
Ｑ Ｕ
Ｎｏ ｌ飞 ｏｕ 。叫
１ 示． 所
叮． 二 ・分 。 １认 ｕ口 。「 。旧 。
０ ． ５０ ７５ ２５ ． ． １ ． １ ． ００ ２５
Ｅ ＡＶ ・ ｍ－ ｃ １
ｐ Ｋ２ 粒［ 带有红霉素抗性基因， ［， Ｔ Ｈ质 ６ Ｒ ］ 分子量
６９ 为大肠杆菌一 ．ｋ， ｂ 乳酸菌穿梭质粒． １２ 培养基与缓冲液 ．
前的转化效率提 高近 １０ ． ０倍
关键词 ： 乳酸乳球菌； 电转化 ； 转化效率
中图分类号：９３ Ｑ３
文献标识码： Ａ
Ｔ ｅ ｔ ｓ ｃ ｄ ｎｆ ｍ ｔｎ ｉｅｃ ｈ ｆ ｏ ａｅｔ ｔ ｓ ｒ ａｏ ｅ ｃ ｎｙ ａ ｒ ｆ ｅ ｒ ｏ ｉ ｆｉ ｃ ｆ ａ ｆ ｏ Ｌｃ ｃｃ ｓ ｔ ｂ ｅ ｃ ｏｏ ｔ ｆ ｔ ｏｃ ｌ ｉ ｙ ｔｐｒｉｏｎ ａ ｏ ｕ ａ ｃ ｌ ｒ ａ ｃ ｅ
电阻大小进行电转化 ． 电阻大小对转化效率的影响 结果见图 ２ ．
呼． 盆 ・令 ＮＯ 工认 。昌 叫ｕ 妇 。
１ ２
１ ０ ８ ６
４ ｕ于 １ ｍ 离心管中， ７ ℃冷ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ保存待用． ０ ． Ｌ Ｌ ５ 一０
１４ ２ 电转化 ．．
取 １ 质粒 Ｎ Ｄ Ａ与４ ｐ ｒ ． Ｌ ０ 的感受态细胞悬浮 Ｌ
ｔ ｎｆ ｍ ｔｎ ｃ ｎｙ ｉ ｃ ｒ ｓ ｒ ａｏ ｅ ｅ ａ ｏ ｉ ｆ ｉ ｆ
溶液 １ ｍ ｘ ７ ｍ ０ ０ ２ １ ＋ ５ ％葡萄糖 ＋ ： Ｌ Ｍ ５ １ Ｌ ３ ｍ ５ ％蔗糖 ＋１ ｍ １％甘氨酸 ＋ ｍ ｄ从０ ４ ０ Ｌ ０ ０ Ｌ ５ Ｌｄ ；
３ ℃培养， ６０ ０ 在 ０ｎ ｍ下测菌液吸光度． Ｏ ＊ 二 当 Ｄ
０４ ０９ 离心收集细胞 ， ３ ｍ 溶液 Ｉ洗涤细 ．一 ． 时， 用 ０ Ｌ
胞２ ， 次 离心去上清后用 １ ｍ Ｌ溶液 Ｉ悬浮细胞 ． 取
固 定电场强度为 １ｋ／ ， ０ ｃ 电容为２ ｐ ， Ｖｍ ５ 改变 ｔ Ｆ
１ ｔ ２ ／ Ｍ Ｃ ＋ ０ ０５ ／ ＣＣ ； ０ ｔ ｍ ｌＬ ｌ ４ ［ ． ｍ ｌＬ ｌ ０ ｏ Ｌ ｇｚ Ｌ Ｌ ｏ ａ２
图 １ 电场强度对电转化效率的影响 Ｆ ． ｆｃｏｅｃｉｆｌ ｓ ｎｔｏ ｉ １ ｆ ｔ ｌｔ ｉｄ ｇ ｎ ｇ Ｅｅ ｆ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｃ ｒ ｅ
由图 ２ 电场强度为 １ ｋ ／ｍ时， 可知， ０ ｃ Ｖ 转化效 率随电阻的增加而增加 ， 在电阻为 ４０ ０ ０时达到最 大． 之后随电阻的增加转化效率反而下降．
２３ 细胞生长时期对转化效率的影响 ．
２ 结果与讨论
２ １ 电场强度对转化效率的影响 ．
第３ 期
孙
磊， ： 等 乳酸乳球菌电转化条件的研究
转化效率低、 稳定性差等缺点闭， 故广泛采用的是电
转化法［． １ 但在当前的实验条件下电转化法并不十 ５ １
分完善， 主要存在转化效率低、 重复性差等缺点． 本
文就影响乳酸乳球菌电转化的几个主要因素进行了
从而发挥更大应用价值〔． ’ 〕
乳酸乳球菌的转化需要一套稳定方便的转化方 法． 目前乳酸乳球菌的转化方法主要有原生质体转