重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究

表达重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究概述

高应瑞（译）

目前，由于基因组序列数据库的快速扩增，重组蛋白的规模化生产已经成为迫切需要。因此，通过基因重组生产蛋白质，必须考虑其蛋白特性和活性构象，以确定它们的生物学功能。如果蛋白质的功能以及其基因的生物学功能未知，无论该蛋白质是在天然结构或在非天然结构，都不能通过生物活性评估来对其进行评估。至今为止,有越来越多的异源重组蛋白成功得到表达。其中大肠埃希氏菌（大肠杆菌）是最常使用的表达系统。然而, 在大肠杆菌中异源表达外源基因往往会导致表达蛋白形成不溶性包涵体（IBS）。包涵体必须经过变性溶解及复性过程后才会恢复其蛋白的生物活性。包涵体复性过程的是一个非常复杂的过程，往往需要经过大量的反复试验才能确定其复性工艺参数。在无活性的包涵体到具有生物活性蛋白的过程中，有两个最重要的影响因素:即包涵体的变性与复性。包涵体蛋白的溶解必须使其蛋白肽链单分子进行分散并使最大程度减少蛋白质分子肽链内以及肽链之间的相互作用。溶剂的选择，如尿素，盐酸胍，或洗涤剂等，在包涵体溶解过程中起关键作用，蛋白质变性溶解之后进行复性。

包涵体蛋白溶解后,即可进行蛋白复性。蛋白复性过程不是单一反应,而蛋白的正确折叠与错误折叠和蛋白聚集的竞争过程。在蛋白复性的竞争过程中,蛋白的复性率主要取决于变性剂的最终浓度以及溶剂的条件。本文主要讨论的重点是复性工艺中对变性剂去除方式、溶剂、小分子添加剂以及工艺条件。

小分子添加剂的作用来自其在体内的功能定位。小分子添加剂能够在生物体缺水的情况下维持体内蛋白质的稳定性，因此被命名为渗透剂[1,2]。在另一个实例中，基因突变，蛋白的错误折叠常常导致蛋白的失活，从而导致机体生长的异常或某些细胞功能的异常。实验已证明在某些小分子添加剂的存在时，这些失活蛋白质能够恢复正常功能，而且细胞能够生长正常。由于小分子能够帮助蛋白质正确折叠，因此他们也被称为化学伴侣。许多小分子添加剂都是渗透剂和化学伴侣。因此，可以确定，无论在体外和体内某些小分子能有效地促进蛋白质的正确折叠及稳定蛋白质结构。

1.包涵体蛋白的变性溶解

尿素，盐酸胍，和强离子洗涤剂如N-月桂酰肌氨酸是最常用的溶解剂。在变性剂溶液中溶解包涵体已经是被公认的一种方法，但是很少有报道，在变性溶液中可能会形成一些低聚合物。在变性剂溶液中，由于变性剂离子的作用,在蛋白复合物之间产生强大的静电斥力，进而将包涵体分散为单分子结构。

如上所述，在变性剂溶液中形成的蛋白质复合体为非天然二级结构。然而,只有在这种复杂的蛋白质复合体形成天然二硫键时才会发挥其功能作用。在月桂酸肌氨酸钠/蛋白质复合物中,观察到了天然及非天然二硫化物的存在，表明在变性剂/蛋白质复合体溶液中有天然和非天然分子内的相互作用(T. Arakawa and T.P.Horan, unpublished results)。这是由于含尿素、盐酸胍的蛋白变性液对包涵体蛋白的结构及其动力学过程存在差异。如图1所示，脲素和盐酸胍与蛋白质的结合度依赖于其浓度大小[5]。

结

合

力

（摩尔）

变性剂浓度（M ）

图1:尿素（◆）和盐酸胍（□）与氧化溶菌酶的结合[5]

本实验所用的溶菌酶含有一对完整的二硫键结构。当二硫键减少(例如在包涵体中)，尿素或盐酸胍就会与其产生强的结合力。结合度是通过平衡透析的方法来测定(T. Arakawa and S.N. Timasheff(未出版)。

通常情况下，浓度为6～8M的尿素和6～7M的盐酸胍可以实现蛋白质的溶解。然而，即使在浓度最高的情况下，蛋白质分子内和分子间发生的相互作用往往也可导致非天然结构的形成,如图2所示。这些非天然的结构可导致聚合物的形成或去变性剂后导致其错误折叠。在含有一定浓度变性剂的非天然结构蛋白溶液中,只要分子的相互作用条件更有利于天然结构的形成,则含有二硫键的蛋白质就可

以形成天然的二硫键结构。在变性剂含量降为中等浓度时(如图1所示),其（尿素和盐酸胍）与蛋白质的结合力也降低，因此，蛋白质分子开始重新折叠。因此，它有可能通过调节盐酸胍和尿素的浓度来调节其与蛋白的结合力，来提高蛋白的复性效率。这种情况不包括洗涤剂在内。洗涤剂与蛋白的结合力决定于其临界胶团浓度(CMC)的大小。这种胶团结合往往在临界胶团浓度之上，即变性非折叠蛋白溶解性好的条件下发生,而这种胶团结合不能或者很少能在临界胶团浓度之下,即蛋白溶解性差的条件下发生[6]。

天然构象

内部分子间的相互作用

分子间的相互作用

图2：非天然结构中分子内与分子间的相互作用[6]

图中所示(图上),天然状态模型的蛋白质有相互作用的螺旋结构（A和B）和彼此间隔较远的疏水区（C 和D）。这种螺旋结构的相互作用在非折叠状态时即消除，而非折叠状态下分子内部(图中右)及分子间(图中下)发生疏水区C和D之间的疏水相互作用。

这表明，只有在洗涤剂存在的条件下，蛋白复性过程才能发生，否则，去除洗涤剂后，蛋白质结构和溶解度又将形成原包涵体。

2.蛋白复性

复性过程是蛋白质构象从展开状态到折叠状态的变化过程。包涵体只能由强变性剂溶解，使其蛋白质成展开状态，其溶解程度主要取决于蛋白质本身及其所使用的变性剂类型。包涵体经过变性剂溶解后的蛋白质为高度可溶性。与纯化的蛋白复性研究不同，包涵体溶解蛋白含有蛋白表达系统产生的杂质，其可能干扰蛋白质的复性。因此，为了减少杂质对复性过程的干扰,可以先对该蛋白质进行纯化。

如图3所示，复性过程是蛋白质构象从展开状态到折叠状态的的变化过程。在高浓度变性剂条件下，蛋白质呈展开（无序）状态，高灵活性及高溶解性。在复性缓冲溶液中，蛋白质呈有序折叠状态，为刚性好，结构紧凑的构象。在理想的情况下，蛋白质分子从高浓度变性剂到复性缓冲溶液将使蛋白质复性，即蛋白质分子将有序折叠成为紧凑的结构。然而，这样一个剧烈的过程通常很难发生，因为条件的剧烈变化会导致其分子的错误折叠和聚集。一旦蛋白分子错误折叠或聚集，在没有变性剂存在的条件下，蛋白分子将不可能自行解聚以及重新折叠成天然构象。如图3所示，复性的关键在变性剂合适的浓度，当变性剂浓度足够低时，以迫使蛋白质分子解聚，并且解聚的蛋白分子溶液可以重新折叠为有序构象。蛋白复性过程中变性剂的最适浓度主要取决于蛋白质以及变性剂浓度的减少方式。

天然构象

折叠度

折叠状态：刚性好，结构紧凑的构象

展开状态：

无序性、高灵

活性、高溶解变性剂浓度

中间构象