细菌分离与鉴定方法

氧化酶试验
原理
氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统 的终末呼吸酶，系由细胞色素a和a3所组成，一般仅存于需
氧菌和兼性厌氧菌中，它使细菌能利用氧作为氢的最终受体， 使分子氧还原为过氧化氢，过氧化氢的积累会有毒性，固本
试验的阳性菌，不仅需氧而且能产生过氧化氢酶。氧化酶并
不是直接与试剂起反应，而是先使细胞色素c氧化，然后此 氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化，产生颜色反应，因而 本试验实际也是测定细胞色素c是否存在。
的1/6～1/5）涂布，划线时，接种环与琼脂表面呈 30°～40°的角度轻轻接
触，利用腕力动作，切忌划破琼脂表面。烧灼接种环，待冷后，将接种环通 过1区划线数次，在2区作连续划线，各线条间隔要小，但不能重叠。划满平
皿的1/5～1/4区域，划完2区不需烧灼接种环，继续通过2区数次，在3区作连
续划线，如此反复至划完整个平皿（如图3）。
图1 接种环的握持方法
图2 平皿的握持方法
1区
2区
4区
3区
图3 划线分离的方法 左：分区 右：培养后的结果
分离方法
• 接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号 笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将 平皿的底朝上，放置在37℃孵箱内孵育24h。 • 取出后观察琼脂表面的菌落分布情况（见图3），
氧化酶试验
• 试剂
1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液或1%二盐酸四甲基对苯二胺水溶
液。 • 方法 在干净的培养皿中放一张滤纸，滴上二甲基对本二胺的1%水溶 液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿。用白金丝接种环（不可用镍
铬丝）取18～24小时的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上，在10s内涂
抹菌苔现红色者这为阳性，(四甲基对本二胺呈蓝色)，10～60s 现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理。
普通琼脂平板
牛肉膏
蛋白胨 氯化氯化钠（NaCL） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 琼脂
3.0g
10.0g 5.0g 1.0g 15.0g
蒸馏水
1000mL
混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，112kPa高压灭菌15min， 冷却至45℃倾注灭菌平板。直径90cm平皿每皿倾入15～20ml培
养基，培养基过少，划线分离时细菌的营养较少，菌落生长过小， 菌落形态不易观察，培养基也易于干燥，不易在数天内对菌落形
革兰氏染色法基本原理
• 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料 和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷， 能和带负电荷的物质结合。酸性染料的离子带负 电荷，能与带正电荷的物质结合。中性染料是前 两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红 天青等。 • 因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱 性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采 用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀 绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、 酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色。约20～30秒钟，立即用水冲净酒精立
即水洗。 • 复染：加番红花红（沙黄液、稀释复红等），染约1分钟。水洗、干燥。 镜检：干燥后用显微镜观察。革兰氏阴性菌成红色。革兰氏阳性均呈紫色。 • 以分散开的细菌革兰氏染色反应为准。过于密集的细菌染色后常常呈假阳性。 • 同法在同一载玻片上以大肠杆菌和葡萄球菌混合纸片，作革兰氏染色对比。
态进行观察。
• 含糖培养基灭菌条件115℃，10～15分钟
• 一般培养基灭菌条件121℃，15～20分钟
细菌的生长状况观察
• 在无菌平皿中，倒入溶化后50℃普通营养琼脂培养基，每 皿约 20毫升，水平静置待凝固。用接种环挑去待分离菌 株分区划线，28℃培养24h。 • 菌落形态观察： 大小：以毫米计。 形状：圆形、不规则形、放射状等。 表面：光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。 边缘：整齐、波形、锯齿状等。 色素：有颜色，颜色，是否可溶等。 透明度：透明、半透明、不透明。 嗜水气单胞菌菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡 黄色，有特殊芳香气味。
嗜水气单胞菌为阳性。
氧化酶试验 注意事项
• 二甲基对本二胺溶液易于氧化，一般于冰箱中储存两周。 如溶液颜色转红褐色，则不宜使用。 • 铁、镍等金属可催化二甲基对苯二胺呈红色，故不宜用以 上材料取菌苔。如无白金丝，可用玻棒或灭菌牙签取菌苔
涂抹。
• 在滤纸上滴加试液已刚刚湿润为宜。如滤纸过湿，妨碍空
气与菌苔接触，延长显色时间，造成假阴性。
AHM鉴别培养
方法
• 以接种针挑取可疑菌落，穿刺接种达于管底，置35±2℃
培养18～24h，如反应不肯定，可继续培养18～24h。
• 气单胞菌典型反应为培养基管底部为变黄，在接近于试管 顶部有紫色带出现。此表明反因为甘露醇阳性，肌醇阴性， 鸟氨酸脱羧酶阴性（鸟氨酸脱羧产生腐胺，可使培养基由 酸变碱）。有时仅在试管顶端部有轻微变黑，此表明是因
•
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
•
吲哚试验
方法 • 将新鲜的菌种接种与上述培养基中，28℃培养24 h。 沿管壁缓缓加入3～5mm高的Kovacs试剂于培养液 表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜 色不明显，可加4～5滴乙醚至培养基，摇动，使乙 醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至 液面后，在加吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲 哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应， 则颜色明显。 • 嗜水气单胞菌吲哚试验阳性
革兰氏染色法
染色：初染 → 媒染 → 脱色 → 复染
• 初染：加草酸结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染1～2分钟，水洗。 • 媒染：滴加碘液冲去残水，并保持碘液覆盖1分钟，水洗。
• 脱色：加95%酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。如此重复2～3次（约30
秒）。水洗。 或用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％
细菌的生长状况观察
原理
◆细菌于适宜条件下在不同的培养基上生长，其生长 状态不同。不同细菌在同一种培养基中生长，生长特点 也不相同。这些区别称之为培养特征，是鉴别细菌和细 菌分类的依据之一。
◆ 把细菌接种在固体培养基上，在适宜的条件下经过 一定时间的培养，在培养基表面（或内部）形成肉眼可 见的有一个细菌大量繁殖后而成的集团，称之为菌落。 不同细菌的菌落大小、光浊度、色泽均有其特征。
法，是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来，
使个别的细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形
成单个菌落，以达到分离获得纯种细菌的目的。
分离方法
具体操作方法如下：
• 点燃酒精灯，右手执笔式握持接种环（见图1），在酒精灯火焰上烧灼接种环，
待冷，取待测菌液一环。 • 左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬 起一些，进行接种（见图2）。或者，将平皿的盖留在实验台上，尽量直立平 皿靠近酒精灯火焰，右手持接种环在琼脂表面的一端（即1区，约占整个平皿
分解半胱氨酸产生硫化氢所致。沿穿刺线全部呈混浊状，
表明该菌具有动力。
吲哚试验
• 原理 细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚(靛基质)，经 与试剂中的 对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚 而呈红色。 培养基 1%蛋白胨水水溶液：调pH7.2～7.6，分装于1/3～ 1/4试管，115℃蒸汽灭菌30分钟。 Kovacs 试剂 对二甲基氨基苯甲醛 5.0g 戊醇 75g（ml） 浓盐酸 25ml
注意观察最后1～2区内是否分离出单个菌落，并
观察记录菌落特征（如菌落大小、形状、透明度、
色素等情况）。
• 烂鳃病病原菌平板划线分离：
取病鱼鳃丝一小块，置于滴有无菌水的载玻片
的边缘，10分钟，用接种环蘸水，在胰胨琼脂培养
基上划线。
• 肠炎病病原菌划线分离： 用70%酒精棉球擦拭鱼体，无菌条件下，取病 鱼的肝或脾或肾或心于普通营养琼脂基划线分离。 • 赤皮病病原菌划线分离： 用刀片刮除病灶腐烂部分后用接种环挂取病料， 在普通营养琼脂培养基上平板划线。28℃培养24h。
使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用番红花红
复染后，细菌被染上复染剂的颜色，即红色。
革兰氏染色法
材料 • 嗜水气单胞菌，葡萄球菌 • 革兰氏染色液；载玻片；显微镜等。 方法 涂片： • （1）取载玻片一张，试净。 • （2）用灭菌的接种环取生理盐水一滴，放于载玻片的中央（如被检材料是液体，可 不加生理盐水）。 • （3）左手斜持菌种管，右手将菌种管棉塞稍加转动，以便拔下。 • （4）右手持接种环，经火焰灭菌后，用右手小指拔开菌种管棉塞，管口通过火焰， 用接种环取少量菌（切不可过多）。 • （5）管口再通过火焰，塞好棉塞。 • （6）将接种环上的细菌加到载玻片的水滴内，磨匀，涂成直径约1厘米大小的薄薄 菌膜。 干燥：将玻片置于空气中，使其自然干燥。 固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜） • 干燥后将涂片在火焰上缓缓通过三次，其目的是使细菌粘于玻片上，染色和冲水时 不易脱落；且细菌为蛋白质，被热凝固后可保持完整形态。 • 固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
细菌分离与鉴定方法 —嗜水气单胞菌分离鉴定
分离方法 细菌的生长状况观察
氧化酶试验
AHM鉴别培养
吲哚试验
革兰氏染色法
糖发酵试验
脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验）
分离方法
用途:
• 在检查含两种或两种以上的待检材料（如肝、脾、肾、 心、肌肉等）中的某种细菌时，须先将待检材料进行 分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线
革兰氏染色原理
革兰氏染色过程：（结晶紫）初染 →（碘液） 媒染 → （95%乙醇） 脱色 →（番红花红） 复染。 • 初染：当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂 的蓝紫色。 • 媒染：碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一 碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。 • 脱色：当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不 同的。革兰氏阳性细菌结晶紫-碘的复合物不易被洗脱 而保留在细胞内，革兰氏阴性菌结晶紫-碘的复合物比 较容易被洗脱出来。 • 复染：革兰氏阳性细菌仍保留初染时的颜色，呈紫色。 革兰氏阴性菌呈红色。
AHM鉴别培养
AHM为Aeromonas Hydrophila Medium 的缩写。 用于可疑气单胞菌菌落的鉴定。
AHM鉴别培养基 ★成分 蛋白胨 5.0g 酵母提取物 3.0g 胰蛋白胨 10.0g L-盐酸鸟氨酸 5.0g 甘露醇 1.0g 肌醇 10.0g 硫代硫酸钠（Na2S2O3· 5H2O） 0.4g 枸椽酸铁胺 0.5g 溴甲酚紫 0.02g 琼脂 3.0g 蒸馏水 1000mL ★制法 将各种成分（除溴甲酚紫外）溶化于1升水中，调pH6.7，加入溴甲酚紫，混 匀煮沸。分装于13×100mm试管，每管 5.0ml，于121℃，灭菌15分钟。 （溴甲酚紫的有效pH范围5.2～6.8，颜色变化：黄～紫）
革兰氏染色法
• 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过 度，则阳性菌被误染为阴性菌。此外，菌龄也影响染色结 果，如阳性菌培养时间过长，或已死及部分自行溶解，都 常呈阴性反应。 结果与思考 • 在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和葡萄球菌被染 成何种颜色？它们是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌？ • 作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关 键一步是什么？ • 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能保证你的染 色技术操作正确，结果可靠？ • G+ G-另一判断方法：取40ul 3%NaOH滴加于洁净的载波 片上，用接种环刮去平板单个菌苔适量，在NaOH滴上研 磨40S，用接种环挑起，若有拉丝现象，则为G-，否则为 G+
革兰氏染色法
• 由丹麦病理学家Christain Gram创立，用 于细菌分类学研究。
• 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 Christain Gram氏创立的，用于细菌分类学 研究。革兰氏染色法是细菌学中最重要的 鉴别染色法。 • 革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰 氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两 大类。
革兰氏染色法原理
革兰氏染色法之所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴
性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
细菌细胞壁的结构 • G﹢菌：细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，细胞
壁厚，结构致密，类脂质含量低，用脱色剂处理后，肽聚
糖脱水而孔径缩小，通透性降低，故革兰氏染色后细菌仍 保留初染时的颜色，呈紫色。 • Gˉ菌：其细胞壁肽聚糖层较薄，交联度低，类脂含量高， 故脱色时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，