酶降解农药

环ຫໍສະໝຸດ Baidu因素的影响
• 环境因素包括温度、酸碱度、营养、氧、 底物浓度、表面活性剂等。农药的生物降 解是一个复杂的过程，影响因素很多。近 年来，人们越来越多地关注到环境对农药 的生物降解的影响，取得了很多成果，在 今后的研究中，尤其在农药生物降解实际 应用中，环境因素将是人们必须考虑的因 素。
农药微生物降解的新技术新方法
• 固定化微生物技术在农药降解中的应用
• 农药降解酶制剂的研制及应用 • 降解基因的克隆、表达及基因工程菌的构 建
固定化微生物技术在农药降 解中的应用
• 自20世纪70年代后期以来，固定化微生物 的研究迅速发展，其应用范围很广。其中 ，应用固定化微生物技术降解污水中的农 药，成为一个新的研究领域。Jiyeon等利用 海藻酸钙固定微生物，对蝇毒磷的降解进 行试验，取得了满意的结果，其降解能力 优于未固定化微生物。
降解农药的微生物类别
• 生态系统中生存着大量的微生物。因其种类 多、分布广、繁殖快、易变异、有很强的生 化适应能力、对各类人工合成杀虫剂能较快 产生适应酶系、完全降解成无机物等特点而 一直为研究污染治理的学者所关注。自然环 境中存在的部分细菌、真菌、放线菌、藻类 等对有机磷农药具有降解作用,目前研究得 比较深入的有细菌和真菌两类。
• 一般情况下，高分子化合物比低分子量化 合物难降解，聚合物、复合物更能抗生物 降解；空间结构简单的比结构复杂的容易 降解；易溶于水的农药比难溶于水的农药 易降解。 • 微生物只能降解特定结构的农药，所以农 药结构决定降解该农药的微生物种类，只 有对污染环境农药的结构充分了解，才能 有效地对其进行生物降解。
• 微生物降解农药的研究方向包括：高效农 药降解工程菌的开发、混合菌的培养、降 解菌的固定化、白腐真菌降解农药的研究 和农药生物降解的模型定量化研究。
• 近年来，伴随着基因工程和分子生物学研 究技术的发展，科研工作者开始把重心转 移到高效工程菌的构建，采用基因重组技 术，将表达高效降解农药的酶的基因构建 到载体中，经转化获得工程菌，以期提高 起降解作用的特定蛋白质或酶的表达水平 ，从而提高降解效率，既能克服一些酶在 环境中不能稳定存在的问题，又保持了酶 的高活性。随着基因工程进一步发展，微 生物在农药降解方面的潜力会得到更充分 的体现。
• 由于固定化细胞对底物和氧气扩散有阻碍 ，使细胞酶活性降低，通过基因工程手段 制备高效工程菌是解决该问题的关键。闫 艳春等克隆抗性库蚊酯酶基因并在大肠杆 菌中高效表达，用海藻酸钠包埋固定化工 程菌，并处理有机氯农药三氯杀虫酯和菊 酯类农药溴氰菊酯，结果表明，固定化工 程菌能高效降解这两种农药。
农药降解酶制剂的研制及应用
降解农药的 微生物类别
针对不同有机磷农药的降解菌
影响微生物降解农药的因素
• 微生物自身的影响 • 农药结构的影响 • 环境因素的影响
微生物自身的影响
• 微生物的种类、代谢活性、适应性等都直 接影响到对农药的降解与转化。已经证明 ，不同的微生物种类或同一种类的不同菌 株对同一有机底物或有毒金属的反应都不 同。
近年来 ,随着分子生物技术研究的深入发展 ,微生物的降解作用亦得到 了长足的发展 ,其主要的降解途径主要有以下几种： 水解作用 : 在微生物作用下,酯键和酰胺键水解,使得农药脱毒,如马拉 硫磷,敌稗等的水解脱毒 . 脱卤作用 :卤代烃类杀虫剂 ,在脱卤酶的作用下,其取代基上的卤被-H和 羧基等取代 ,从而失去毒性 ,如DDT降解变为DDE即属此类反应. 氧化作用 :微生物通过合成氧化酶 ,使分子氧进入有机分子 ,尤其是带 有芳香环的有机分子中 ,插入1个羟基或形成1个环氧化物 ,如多菌灵. 硝基还原 :在微生物的作用下,将农药中的-NO2 ,还原为-NH2 ,如将对硫 磷还原为氨基对硫磷. 甲基化 :有毒酚类加入甲基使其钝化 ,如五氯酚 ,四氯酚等. 去甲基化 :含有甲基或其他烃基 ,与N,O,S相连,脱去这些集团转为无毒, 如敌草隆的降解即脱去两个N-甲基 . 去氨基 :脱去某些农药分子上的氨基 ,从而实现脱毒作用.
• 直接应用有机磷农药降解酶制剂比应用 产酶的菌剂更有优势。产有机农药降解 酶的天然菌株其有机磷农药降解酶是胞 内酶,做为菌剂应用时,必须使菌体生长繁 殖,在此过程中缓慢分解农药做为营养源, 其农药降解缓慢且对保证菌株的正常生 长的环境条件要求严格,而做为酶制剂直 接应用时,其农药降解速度快,一般只需数 分钟就可使农药80%以上降解,同时由于 此酶的酶解条件要求并不严格,有利于其 在生产实践中的实际应用。
• 当有机磷农药与微生物混合后,通过对微生 物的某种刺激,促使微生物自身所含有的酶 迅速增加或因基因适应性改变而形成具有 降解效果的酶,在这些酶的作用下,有机磷中 的P—S, P—O,P—N等键被打断,使有机磷 农药被降解,生成简单无机化合物。
微生物降解有机磷农药残留的作用方式 • 常见的作用方式有3种： （1）矿化作用：指微生物将有机磷农药作为 生长基质利用，完全将有机磷农药分解成为 PO43-、NH3、CO2和H2O 等无机物的过程。尽管矿 化作用是清除农药残毒的理想方式，但研究表 明自然界中此类微生物的种类和数量还很少。
存在的问题及展望
• 目前已相继分离和鉴定了各种降解农药的 微生物菌株(包括细菌、真菌等)，但是利用 微生物进行生物修复的实际应用却往往由 于其降解效率较低而受到影响。农药微生 物降解的问题主要有以下几方面：(1)单一 菌株的纯培养问题；(2)环境条件对微生物 降解农药的影响；(3)受农药污染的环境及 食品不能进行有效的处理；(4)微生物与被 降解物接触的难易程度；(5)微生物的适应 性问题。因此，农药降解菌从实验室到实 际应用还有一段路要走。
（2）共代谢作用：指微生物在有其可利用 的生长基质存在时，对其原来不能利用的有 机磷农药也可分解代谢的现象。共代谢反应 中产生的既能代谢转化生长基质又能代谢转 化有机磷农药的非专一性酶，是微生物共代 谢反应的关键。 （3）种间协同代谢：指同一环境中的几种 微生物联合代谢某种有机磷农药。
微生物法降解有机磷农药途径
• 微生物具有较强的适应和被驯化的能力， 通过一定的适应过程，新的化合物能诱导 微生物产生相应的酶系来降解，或通过基 因突变等建立新的酶系来降解。微生物降 解本身的功能特性和变化也是最重要的因 素。
农药结构的影响
• 农药化合物的分子量、空间结构、取代基 的种类及数量等都影响到微生物对其降解 的难易程度。不同化学结构的农药，生物 降解性由易到难依次为脂肪酸类、有机磷 酸盐类、长链苯氧基脂肪酸类、短链苯氧 基脂肪酸类、单基取代苯氧基脂肪酸类、 三基取代苯氧基脂肪酸类、二硝基苯类、 氯代烃类。
酶降解有机磷农药
农药降解研究领域日趋活跃,研究者们相继 对除草剂、杀虫剂、杀菌剂等的微生物降解 进行了深入细致的研究。通过近几十年的研 究,已经确定了微生物在土壤和水环境的农 药降解中起主要作用。研究者分离到一批能 降解或转化某种农药的微生物类群,逐步弄 清了微生物降解农药的主要作用方式及降解 机制,以及各类化学农药的微生物降解途径。
• Mester等认为当微生物对有机化合物的降 解作用是由其细胞内的酶引起时,微生物降 解的整个过程可以分为3个步骤:首先是化合 物在微生物细胞膜表面的吸附,这是一个动 态平衡;其次是吸附在细胞膜表面的化合物 进入细胞膜内,在生物量一定时,化合物对细 胞膜的穿透率决定了化合物穿透细胞膜的 量;最后是化合物进入微生物细胞膜内与降 解酶结合发生酶促反应。
• 固化酶对环境条件有较宽的忍受范围，可 用于农药及类似结构的环境污染物的净化 。用降解酶净化农药具有良好的效果，能 否应用取决于稳定性及固定化技术的实用 性，降解酶的获得可通过生物技术对降解 农药的基因进行克隆、基因的高效表达来 实现。
降解基因的克隆、表达及基因工程菌 的构建
• 分子生物学的迅猛发展为农药降解菌从实 验室走向实际应用提供了可能。人们寄希 望通过基因工程技术将农药降解酶基因或 降解质粒克隆到合适的宿主菌中并使其高 效表达，构建“高效农药降解菌”，为农 药的微生物降解开辟一条新途径。这一领 域已成为当今环境生物技术的研究热点之 一，也是今后工作的重点。
微生物降解有机磷机理
• 有机磷农药的微生物降解过程:一种是微生 物本身含有可降解该种农药的酶系基因,当 有机磷农药进入土壤后,微生物马上应激产 生出可降解有机磷农药的降解酶,在这种情 况下,降解菌的选育较为容易,选育周期也较 短;另一种是微生物本身并无可降解该有机 磷农药的酶系或相关基因,当农药进入环境 以后,环境中微生物由于生存的需要,微生物 的基因发生重组或突变,产生新的降解酶系
• 南京农业大学刘智等通过鸟枪法克隆到一 个大小为25 000个碱基对左右的甲基对硫 磷水解酶基因,并将其转化至大肠杆菌中。 同时他还构建了能降解有机氯及有机磷和 同时降解3种以上有机磷农药的降解菌各1 株,能同时高效降解甲基对硫磷和呋喃丹农 药的工程菌1株,在实验室条件下降解性能 显著,酶活性提高6倍,获得既有农药降解能 力又有生物防治功能的工程菌株。
• 微生物之所以能被广泛地应用于有机磷的降 解处理,都是微生物体内产生的具有强大催化 作用的生物催化剂---酶作用的结果。另外,如 果用微生物产生的酶来处理农药残留而不是 直接使用微生物菌株，那么对环境造成威胁 或潜在威胁的风险即可降低。研究表明，一 些酶比产生这类酶的微生物菌体更能忍受变 异的环境条件，如对硫磷水解酶可耐受高达 10％的盐浓度和50℃的温度，而产生这种酶 的假单胞菌在这种条件下却不能生长。
• 常见的有机磷农药降解酶主要是水解酶类 ，包括磷酸酶、对硫磷水解酶、酯酶、硫 基酰胺酶、裂解酶等，它们降解有机磷农 药分子时,通过破坏有机磷的磷酯键而使其 脱毒。由于各种有机磷农药都有类似的结 构,只是取代基不同,所以一种有机磷农药降 解酶往往可降解多种有机磷农药。有机磷 农药降解酶目前已被公认为是消除农药残 留的最有潜力的新方法。