实验十二 产蛋白酶菌株的筛选

二 实验目的
学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白 酶产生菌的方法 学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法
三 基本原理
自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平 板上生长后， 板上生长后，其菌落周围可形成明显的 蛋白水解圈。 蛋白水解圈。 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断 该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。 该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
2 酶活标准曲线的制作 用酪氨酸配制0~100 g/mL的标准溶液 0~100μ 的标准溶液， 用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液， 取不同浓度的酪氨酸1mL 1mL与 0.4mol/l 取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、 Folin试剂混合 试剂混合， ℃水 Na2CO3、1mL Folin试剂混合，40 ℃水 浴显色30min 680nm测定吸收值并绘制 30min， 浴显色30min，680nm测定吸收值并绘制 标准曲线，求出观密度为1 标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨 酸质量（ ），及 酸质量（ μg ），及K值。
PH11硼砂 NaOH缓冲液 硼砂19.08 硼砂缓冲液： （3）PH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂19.08 克溶于1000ml水中；NaOH4g， 1000ml水中 克溶于1000ml水中；NaOH4g，溶于 1000ml水中 二液等量混合。 水中， 1000ml水中，二液等量混合。 2%酪蛋白 称取2g干酪素， 酪蛋白： 2g干酪素 （4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量 NaOH润湿后适量加入pH11的硼 润湿后适量加入pH11 0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼 NaOH缓冲液 加热溶解， 缓冲液， 砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至 100ml，4℃冰箱中保存 冰箱中保存， 100ml，4℃冰箱中保存，使用期不超过 一周。 一周。
3 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株 取少量土样混于无菌水中， 取少量土样混于无菌水中，梯度稀释后 涂布到牛奶平板上， ℃培养30h左右 培养30h 涂布到牛奶平板上，37 ℃培养30h左右 观察 建议用地衣芽孢杆菌作为对照菌株
4 产蛋白酶菌株的观察与转接 对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌 数进行记录，选择蛋白水解圈最大的5 数进行记录，选择蛋白水解圈最大的5个 菌株进行测量和记录菌落和透明圈得直 然后转接到肉汤琼脂斜面上， 径，然后转接到肉汤琼脂斜面上，37 ℃ 培养过夜。 培养过夜。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形 成蛋白水解圈， 成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条 件和液体环境中生长的情况相差很大， 件和液体环境中生长的情况相差很大， 因此在平板上产圈能力强的菌株不一定 就是碱性蛋白酶的高产菌株。 就是碱性蛋白酶的高产菌株
碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国 颁布标准QB747 80进行 QB747- 进行。 颁布标准QB747-80进行。 原理：Folin试剂与酚类化合物 原理：Folin试剂与酚类化合物 Tyr,Trp,Phe） （Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应 形成蓝色化合物， 形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白 生成含酚基的氨基酸与Folin Folin试剂呈蓝色 生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色 反应， 反应，通过分光光度计测定可知酶活大 小。
实验十一 产蛋白酶菌株的筛选
碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性 碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性 PH 的蛋白酶，在轻工、食品、 的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中 用途非常广泛。 用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白 酶都是胞外酶，具有产酶量高， 酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大 规模工业生产等优点， 规模工业生产等优点，被认为是最重要 的一类营业性酶类。 的一类营业性酶类。
5 用发酵培养基测定蛋白酶菌株的碱性蛋 白酶活力 用初筛获得的5 用初筛获得的5株蛋白酶菌株接种到发 酵培养基中， ℃、 酵培养基中，37 ℃、200r/min 摇床培 48h。 养48h。
6 酶活力的测定
空白对照 发酵液（或其稀释液） 发酵液（或其稀释液）1ml 0.4mol/L 三氯醋酸 3ml 2% 酪蛋白 ml 酪蛋白1 样品 发酵液（或其稀释液） 发酵液（或其稀释液）1ml 2% 酪蛋白 ml 酪蛋白1 40℃水浴保温10min 0℃水浴保温10min 0℃水浴保温 0.4mol/L 三氯醋酸 3ml 静置15min，使蛋白质完全沉淀，然后用滤纸过滤，滤纸应清亮，无絮状物 ，使蛋白质完全沉淀，然后用滤纸过滤，滤纸应清亮， 静置 滤液1ml 滤液 0.4mol/l Na2CO3，5ml Folin试剂 试剂1ml 试剂 40℃水浴保温20min ，于680nm处测定OD值 ℃水浴保温20min 680nm处测定OD值 处测定OD
四 操作步骤
1 培养基和试剂的配制 牛奶平板： （1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培 养基中添加终质量浓度为1.5% 1.5%的牛奶 养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 发酵培养基：玉米粉4% 黄豆饼粉3% 4%， 3%， （2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%， Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l 调节pH pH到 NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌 20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 三角烧瓶的装瓶量为50ml 20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一 直是微生物学的一项重要工作， 直是微生物学的一项重要工作，也是学 习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一 实验器材
1 菌株
从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2 溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素， 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素， 三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂 试剂， 三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼 酪氨酸， 砂，酪氨酸，水等 3 仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒， 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒， 玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计， 玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养 摇床，高压灭菌锅， 摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤 纸
碱性蛋白酶活力单位U 以每毫升样品在40 碱性蛋白酶活力单位U，以每毫升样品在40 pH11条件下 条件下， ℃，pH11条件下，每分钟水解酪蛋白所产生 的酪氨酸质量（）来表示。 （）来表示 的酪氨酸质量（）来表示。 U=K× U=K×A×N×5/10 K：由标准曲线求出光密度为1是相当的的 由标准曲线求出光密度为1 酪氨酸质量，本实验K=200 酪氨酸质量，本实验K=200 N：稀释倍数 样品OD值与空白对照ＯＤ OD值与空白对照ＯＤ值之差 A：样品OD值与空白对照ＯＤ值之差 5/10： 5/10：测定中吸取的滤液是全部滤液的 １ 而酶反应时间为１０ １０ｍｉｎ /５，而酶反应时间为１０ｍｉｎ
实验报告
１结果记录 ２思考题 （１）在选择平板上分离获得蛋白酶产生菌 的比例如何？试结合采样地点进行分析。 的比例如何？试结合采样地点进行分析。 （２）在选择平板上形成蛋白透明水解圈大 小为什么不能作为判断菌株产蛋白酶能力 的直接证据？ 的直接证据？试结合你初筛和复筛的结果 分析。 分析。