α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法

2.2实验方法

2.2.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法

2.2.1.1 反应溶液的制备

（1）配制底物PNPG溶液：精确称取0.3766gPNPG，加适量0.1mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶准确定容到50mL，配制成25mmol/L的母液。将母液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7个不同梯度的标准品溶液，备用。

（2）配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/mg）用0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。

（3）配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000μg/mL DNJ标准母液。将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60μg/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。

（6）0.2mol/L的Na2CO3：称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。

2.2.1.2 PNP标准曲线的绘制

精确称取0.0278g对硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100μmol/L的标准溶液。取100μl上述标准液，各加入150μL 0.2mol/L 的Na2CO3，混匀 1 min ，再于405 nm处测定其吸光度，得标准曲线方程：

y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998)，其中y 为浓度，x为吸光值。

2.2.1.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

测定方法参照Masao Hattori等试验条件，并做调整。实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按表中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。按表依次加入PBS缓冲液、抑制剂溶液和底物，混合均匀，于37℃水浴保温10min，结束后，取出，加入37℃水浴的酶溶液，充分混匀，于37℃水浴反应20min，结束后加入150μL 0.2mol/L的Na2CO3溶液中止反应。由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP，PNP在405nm处有最大吸收，其测定其吸光度，根据公式便可计算出各样品α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50值。

()()%100A A A A A A %B C SB S B C ⨯----=抑制率 公式

表 4 各反应物添加计量和顺序 （单位：μL ）

Table 4 The respective reactants add measurement and sequence ( Unit: μL )

试剂

空白组 对照组 样品空白组 样品组 PBS 溶液

80 70 60 50 抑制剂

0 0 20 20 PNPG 底物

20 20 20 20 充分混匀，37℃下孵化10min 酶溶液

0 10 0 10 充分混匀，37℃下反应20min 碳酸钠 150 150

150 150 2.2.2单因素试验设计

以底物浓度、酶浓度、酶促反应时间和添加顺序为考察因素，以DNJ 的α-葡萄糖苷酶抑制率为衡量指标，进行单因素试验。固定反应顺序为抑制剂+酶再加底物、底物浓度为2.0mmol/L ，酶浓度0.3u/mL ，缓冲液pH 为6.80，反应时间为20min 。

2.2.2.1反应物添加顺序

分别考察如下三种不同的反应顺序对抑制活性的影响。

a 、抑制剂+底物→37℃温育10min→+酶，反应20min→碳酸钠终止反应→测定

b 、抑制剂+酶→37℃温育10min→+底物，反应20min→碳酸钠终止反应→测定

c 、底物+酶→37℃温育10min→+抑制剂，反应20min→碳酸钠终止反应→测定

2.2.2.2 底物浓度

选DNJ 和拜唐苹为抑制剂，以其α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察0.5、1.0、2.0、4.0、5.0mmol/L 这5个不同梯度的底物对抑制活性的影响。

2.2.2.3酶浓度

选DNJ 和拜唐苹为抑制剂，以其α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察0.1、0.3、0.5、0.7、0.9u/mL5个不同浓度的酶对抑制活性的影响。

2.2.2.4缓冲液pH

选DNJ 和拜唐苹为抑制剂，以其α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，分别考察不同pH6.6、

6.8、

7.0、7.2和7.4的缓冲液对抑制活性的影响。

2.2.2.5 反应时间

选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察10、20、30、40和50min不同反应时间对抑制活性的影响。

参考文献

[1] Ma C M, Hattori M, Daneshtalab M, et al. Chlorogenic acid derivatives with alkyl chains of different

lengths and orientations: potent alpha-glucosidase inhibitors[J]. J Med Chem, 2008,51(19):6188-6194.