亲和色谱法及其在我国的研究发展状况

亲和色谱法及其在我国的研究发展状况

【摘要】：亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。技术蓬勃发展，中国色谱专

家同时也非常注重国际间色谱技术的交流。随着国际间交流加深，中国的色谱技术已经跟上了世界的步伐。色谱与生命科学

的交叉研究、色谱与其它分析技术的联用表现得异常活跃。

【关键词】：亲和色谱历史现状

1．亲和色谱

1.1色谱概述

20世纪初，俄国植物学家茨维特首次提出色谱法。他把碳酸钙粉末装到玻璃管中，将植物叶

子的石油醚萃取液作为样品倒入管内，然后再用石油醚自上而下洗脱。随着洗脱的进行，植物叶子中的各种色素向下移动逐渐形成一圈圈的色带，茨维特将这种色带分离过程称为色谱，所用的玻璃管内的碳酸钙填充物称为固定相,洗脱用的石油醚称为洗脱液或洗脱剂，也就是我们常说的流动相。后来，采用该法分离了许许多多的物质，虽然分离过程中看不到色带存在，但色谱法一直沿用至今。

色谱法在当今物质尤其是具有生物活性物质的分离中起到举足轻重的作用。然而在色谱发展的早期有许多的人往往将色谱看做一种艺术, 但是随着色谱理论的发展，以及色谱技术的不断推广，色谱逐渐的称为了一种科学。对于从事生物大分子分离的物质常常用一句话来形容色谱的重要作用：“色谱技术是当今生物工程下游技术的核心”。当今的色谱法包括分离和检查两部分，能够同时实现分离和分析。色谱法也必定会随着材料、生物等多学科研究的深入会更加广泛的应用到分离科学和分析化学之中的。

将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原

和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种

特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法。

在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称

为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。

亲和色谱法的基本过程是：

1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称

亲和性）。

2.亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。

3.解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来

亲和色谱是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去处或减少混合物中某一分子的含量。

亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的基团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。如果分离的目的是去除溶液中某种分子，那么只要分子能与介质结合即可，可以不必进行洗脱。

1.2一般流程

亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的基团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。如果分离的目的是去除溶液中某种分子，那么只要分子能与介质结合即可，可以不必进行洗脱。

1.3特殊应用

亲和色谱的用途很广泛，可以用来从细胞提取物中分离纯化核酸、蛋白，还可以从血浆中分离抗体。分离重组蛋白就经常使用亲和色谱。通过基因修饰为蛋白加上一些人为的特性，这些特性使蛋白选择性地与配体结合，从而达到分离的目的。亲和色谱的另一大用途是从血浆中分离抗体。1.4影响亲和色谱的因素

1.4.1上样体积

若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。

1.4.2、柱长

亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果亲和介质的载量高，与目标产物的作用力强，可以选择较短的珠子；相反，则应该增加柱子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。

1.4.3、流速

亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢，保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间结合力弱和样品浓度过高时。

1.4.4、温度

温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲和力，充分地结合；而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。例如，一般选择在4℃进行吸附，25℃下进行洗脱。

2．研究现状

膜亲和色谱是人们将亲和色谱和膜技术结合起来研制的，以膜为基质的亲和色谱，其基本原理是将微滤膜或超滤膜经表面改性活化处理后，偶联上合适的配基，使固定在膜载体上的配基特异性地与待分离的生物大分子结合成复合物，再经洗脱是生物大分子得以分离纯化。因此亲和膜色谱技术即具有膜技术分离快，处理量大的特点，又具有亲和色谱特异性高的优点。目前亲和膜色谱法已成为分离纯化生物大分子的重要手段之一。链接到膜基质上的配体分为两大类：生物特异性配体和基团特异性配体，后者又称为通用性配体。以此为依据，可以对膜亲和色谱法进行分类，常见的有生物亲和色谱，免疫亲和色谱，金属螯合亲和色谱等。

生物亲和色谱中连接到基质上的配体是存在特异性相互作用的生物大分子，如酶与底物，酶与抑制剂，激素与受体等，因而具有高度的选择性。但是这类生物大分子通常价格昂贵且不易连接到基质上，限制了它们在大规模工业生产中的应用。

免疫亲和色谱是将抗原抗体中的一方连接到基质上来吸附纯化另一方的色谱分离技术。随着可利用的单克隆抗体技术的发展，免疫亲和色谱的应用日益广泛，期工业化应用前景广阔。

金属螯合亲和色谱又称固定化金属螯合亲和色谱，是Porath等首先提出来的。在上世纪70年代他们将铜离子、锌离子通过螯合剂亚氨基二乙酸交联到Agatose上，利用金属离子与蛋白质表面组氨酸等的配位作用选择性的分离对金属离子有亲和里的蛋白质。期理论基础是不同条件下配位键的形成和解离，即过渡金属离子(铜，铁，锌，镍等)与蛋白质表面的组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等电子供体形成配位复合物，因而连接上这些金属离子的载体就能选择性的吸附含有咪唑基或巯基的肽类或蛋白质。吸附力的大小在很大程度上取决于蛋白分子表面咪唑基或巯基的稠密程度。此外，不同的金属离子对亲和力大小也有影响。80年代，人们又提出用微孔的膜作支撑基质，充分发挥了膜过程设备简单，易放大，成本低，分离速度快，可连续操作等优点，是生物工程产品的工业化大规模分离纯化得以实现。一、中国色谱技术的发展历程有机高分子方面应用

亲和色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生物大分子的分离纯化是有特殊意义的。如果说前面所介绍的几种色谱方法都是通用性分离技术的话，那么;23 方法则基本上是属于专一性的，前者是根据溶质分子之间在物理化学性质方面的差异所建立的分离方法，后者则利用了生物分子之间特异性相互作用而实现分离的。这种特异性相互作用是活性生物大分子固有的特征，例如酶能与底物、抑制物、辅酶等结合，抗体能与互补的抗原相结合，凝集素能与细胞的表面抗原以及某些糖类相结合，激素能与蛋白及细胞受体形成复合物，基因可与核酸和阻遏蛋白相互作用等等。所以，原则上讲，如果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基，就可以建立一种亲和色谱方法，用于分离与配基相对应的物质。

亲和色谱的显著特点是，具有其他分离技术所不能比拟的高选择性，而且能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高，所以这种技术用于纯化酶、抗体、核酸、辅助因子和各种能识别、贮存和运载具有生化和药理作用物质的蛋白质，用于生物样品解离常数和平衡常数以及动力学序列和结合机制的研究等，都是很有意义的。

有机高分子类型的AFC填料，按其基质材料，可分为多糖型和高聚物型两大类；按其配体性能即填料所携带配体对被分密物质的选择性特征，可分为专用性和通用性两大类。专用性填料，例如基于抗原与抗体、激素与受体蛋白等特异性相互作用的填料，其配体对于目标化合物有很高的特异选择性和亲和能力。通用性填料因其配体可与数种生物分子产生亲和作用，显然达不到专一的选择性，但这类配体的种类很多，价格低廉而容易获得，应用范围非常广泛，所以在亲和色谱中仍处于主导地位。常见的通用性亲和配体，主