现代育种原理与方法

蛋白质相互作用及其研究方法

摘要：随着人类基因组和其它物种基因组序列测定计划的顺利完成，生物学的研究从基因组时代步入后基因组时代。作为后基因组时代的重要研究领域之一的以蛋白质间相互作用研究为中心发展起来的蛋白质组学已经成为当今生命科学研究的热点和前沿领域。研究细胞内所有蛋白质的相互作用即相互作用组，分析各种蛋白质复合物的组成及其作用方式对于我们理解生物体的复杂运行机制至关重要。

关键词：蛋白质组学噬菌体展示技术酵母双杂交系统串联亲和纯化

随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能，一门新的学科——蛋白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体，其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的，这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中，相互交叉形成网络，构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此，对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一[1]。在过去的几年时间里，研究人员提出了很多的方法来研究蛋白质相互作用，有生物方法，也有计算生物学的方法。在这些方法之中,基于蛋白质序列的预测方法得到了极大的关注。这类方法不需要先验知识，可以广泛地用于蛋白质相互作用的研究之中。

1. 蛋白质-蛋白质相互作用概述

1.1蛋白质的功能

蛋白质是由氨基酸通过肤键构成的生物大分子化合物，生物体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。一些重要的蛋白质功能包括：(1)酶的催化，例如淀粉在消化道内由于淀粉酶的催化作用，迅速的被水解成单糖和双糖；(2)运输和贮存，例如在细胞膜中，许多膜蛋白起运输葡萄糖、氨基酸等营养物质的作用；(3)调节蛋白，例如激素通过与靶细胞相互作用发挥代谢上的作用；(4)机械支持，例如骨头和皮肤的拉力强度是由于存在胶原蛋白。大多数结缔组织主要由它构成；(5)保护蛋白，例如免疫系统中抗体蛋白保护生物体不被其它生物入侵或保护生物体免受损害。

由于高通量测序技术的发展，多个物种的基因组被测序。但是在这些基因组中大部分基因所表达的蛋白质的功能是未知的。此外，由于蛋白质功能的复杂性和多样性,很多蛋白质还有未被发现的功能。目前利用计算方法对蛋白质功能进行预测和注释已成为越来越有效的一种手段。

细胞内大多数蛋白质主要是通过蛋白质一蛋白质相互作用来实现其功能。蛋白质相互作

用存在于生物体每个细胞的生命活动过程中，相互交叉形成网络，构成细胞中一系列重要生理活动的基础。我们可以利用蛋白质之间的相关性，对未知功能的蛋白质进行注释,也就是根据蛋白质相互作用网络中某个蛋白质的连接情况从整体水平上预测蛋白质的功能[2]。1.2 蛋白质的相互作用

蛋白质是细胞生命活动的重要执行者和调控者。尽管有一些蛋白质是以单体的形式发挥作用，但大部分蛋白质却是通过与其它蛋白质或者配体分子结合来参与细胞中的生命活动。蛋白质分子的相互作用包括多种方式，有蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-DNA相互作用，蛋白质-RNA相互作用等。

蛋白质-蛋白质相互作用(Protein一protein interaction,PPI)指的是一个蛋白质与另一个蛋白质之间的相互关系，它们之间可以直接接触(物理相互作用)，也可以不接触，而仅是功能上关联(遗传相互作用)。蛋白质一蛋白质相互作用在生命活动中起着核心作用，例如：DNA 复制、转录、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息转导等众多生命过程中均涉及到蛋白质相互作用。蛋白质与蛋白质之间相互作用的研究将能够从分子水平上揭示蛋白质的功能，帮助揭示生长发育、新陈代谢、分化和凋亡等细胞活动的规律。同时，正确理解蛋白质相互作用也为探讨疾病机理、疾病治疗、疾病预防以及药物靶点发现和药物设计等方面提供了重要的理论基础。

1.3 蛋白质相互作用机理

蛋白质相互作用在很大程度上是由疏水效应驱动的，氢键和静电相互作用也起着至关重要的作用。此外，共价键也是很重要的。蛋白质相互作用的物理化学原理是一般性的，在体外检测到的很多蛋白质相互作用是生物实验中的过表达或者晶体效应造成的，从而加大了蛋白质相互作用研究中的复杂性。

为了能够准确预测蛋白质相互作用，我们也需要从化学角度来研究蛋白质之间的相互联系，包括形状互补、氨基酸残基组织、以及物理/化学结构成分对相互作用稳定的贡献等。蛋白质是通过其表面区域\与另外一个蛋白质发生相互作用的。因此对蛋白质相互作用研究的焦点也就集中在蛋白质的结合表面这一部分。一般我们是通过计算残基或原子的溶剂可及表面积(solvent accessible surface area,SASA)来判断蛋白质中哪些残基或原子是处于蛋白质结合面的。如果一个蛋白质分子与另一个蛋白质分子之间有相互作用，那么位于其中一个蛋白质分子表面的原子将会与对应的另一个蛋白质分子表面的原子发生相互作用。为了理解蛋白质分子间的相互作用，人们对蛋白质相互作用结合面的性质作了深入研究。这些性质包括相互作用的强度!结合面的形状及组成!残基的疏水性、进化保守性、溶剂可及表面积和二级

结构等。虽然这些属性对于我们理解蛋白质相互作用来说都是必要的，但它们对蛋白质之间结合的描述还是远远不够的。这也是目前要正确预测蛋白质相互作用所面临的一个很大困难[3]。

1.4 蛋白质结合面中的热点残基

热点残基通常被定义为丙氨酸突变后引起结合自由能的变化值大于等于2.0kcal/mol的那些结合面上的残基。热点残基有聚集在一起的倾向，它们之间的相互接触而形成了一个相互作用网络，我们称之为热区(hot regions)。由于结合面大小的不同，一个蛋白质相互作用结合面上可能有多个热区。在一个热区内的热点残基对复合物的稳定所发挥的作用是协同性的；而各个热区之间是相互独立的，它们对蛋白质复合物的稳定性作用则是具有累加性的[4]。这就说明在紧密包装的热区之间，是有一定的空隙的,从而使得蛋白质之间的结合是有一定的柔性的。这与蛋白质的折叠过程是有一定的相似性的。

2. 蛋白质相互作用的实验方法

最初研究蛋白质相互作用的方法都是基于生物实验的方法，诸如电泳，层析，质谱分析，核磁共振等技术。这些生物实验技术在蛋白质组学的相关研究中自始至终一直发挥着极其重要的作用。随着新技术的发展，蛋白质研究进入了新的阶段，高通量技术的发展使得在更短的时间内鉴定出更多的蛋白质及其相互作用关系成为可能。迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法，为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。

2.1 噬菌体展示技术(PDT)

1985年，美国Missouri大学Smith博士等人[5]将RI核酸内切酶基因片段连接到丝状噬菌体fd编码次要外壳蛋白的基因Ⅲ中，成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。后经验证，该噬菌体能被EcoRI核酸内切酶抗体有效中和，说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性，这一试验的成功标志着噬菌体展示技术(Phage display techniques, PDT)的诞生。

噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。1990年Scott等人[6]利用噬菌体展示技术构建了随机多肽文库，该文库由特定长度的随机短肽组成，理论上包含了某一固定长度短肽所有氨基酸的排列组合方式。由于蛋白质间的识别与结合主要取决于局部肽段中少数几个氨基酸，所以用受体蛋白对随机肽库进行亲和筛