转基因大豆质粒DNA标准物质的研制

贝。开展了质粒 DNA 标准物质的均匀性、稳定性、检测适用性、定值及不确定度评
价。结果表明，在实时荧光定量 PCR（ qPCR） 检测中，质粒 DNA 的 4 种转基因插入
元件分别与大豆内源基因 Lectin-1 的比值为 0． 98 ± 0． 06 （ CaMV35S： L-1） ，0． 95 ±
第 35 卷 第 5 期 2016 年 5 月
实验室研究与探索
RESEARCH AND EXPLORATION IN LABORATORY
Vol． 35 No． 5 May 2016
转基因大豆质粒 DNA 标准物质的研制
梁 文， 许 丽， 李兰英， 李 妍， 闻艳丽， 徐 勤， 任淑贞， 刘 刚
（ 上海市计量测试技术研究院 化学与电离辐射所，上海 201203）
FAM-CACCCAGCCGGCCACAGTCGATNPTII-P
TAMRA
FMV35S FMV35S-F AAGACATCCACCGAAGACTTA
FMV35S-R AGGACAGCTCTTTTCCACGTT
wk.baidu.com
FAM-TGGTCCCCACAAGCCAGCTGCTCGAFMV35S-P
TAMRA
Lectin-1 L-1-F GCCCTCTACTCCACCCCCA
LIANG Wen， XU Li， LI Lan-ying， LI Yan， WEN Yan-li， XU Qin， REN Shu-zhen， LIU Gang （ Chemical and Ionizing Radiation Metrolology Institute，
Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology，Shanghai 201203，China）
TAMRA
NOS
NOS-F ATCGTTCAAACATTTGGCA
NOS-R ATTGCGGGACTCTAATCATA
NOS-P
FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGGTAMRA
NPTII NPTII-F AGGATCTCGTCGTGACCCAT
NPTII-R GCACGAGGAAGCGGTCA
本文首先构建的质粒 DNA 标准物质含有 4 个转 基因插入元件和一个大豆内源基因，测序验证各转基 因元件和内源基因的比例均为 1∶ 1； 然后优化了 qPCR 法检测靶标基因的引物探针和 PCR 体系，并用该体系 研究了质粒 DNA 的均匀性、稳定性、检测适用性、量值 及不确定度评价，为其作为转基因检测阳性标准物质 提供数据支持。
0． 06（ FMV35S： L-1） ，1． 05 ± 0． 08 （ NOS： L-1） ，1． 11 ± 0． 08 （ NPTII： L-1） （ k = 2） ，靶 基因扩增的标准曲线 R2 ＞ 0． 99，可用于转基因检测实验室的结果质量控制，能力验
证等活动。
关键词： 转基因大豆； 质粒标准物质； 不确定度评定
Abstract： In order to find a simplified and accurate detection of the genetically modified soybean and its processed food， we developed an unique plasmid molecule for genetically modified soybean PCR analysis，it contained four exogenous target DNA element of genetically modified organisms （ CaMV35S，NOS，NPTII and FMV35S） ，and one element of soybean endogenous （ Lectin-1 gene，L-1） ． All the target genes were inserted into the plasmid with single copy． We quantified the ratios of the exogenous target DNAs and the L-1 as the certified valued of the reference material，and we evaluated the uniformity，stability，and the uncertainty，and examined the applicability of our plasmid． The certified values and expanded uncertainties （ k = 2） for the candidate reference material in the real time PCR were 0． 98 ± 0． 06 （ CaMV35S： L-1） ，0． 95 ± 0． 06 （ FMV35S： L-1） ，1． 05 ± 0． 08 （ NOS： L-1） ，1． 11 ± 0． 08 （ NPTII： L-1） ，respectively． The R2 values of the standard curve for target genes were all higher than 0． 99． The plasmid reference material can be used in quality control and proficiency testing for GMOs analysis． It is innovative that plasmid DNA standard material containing multiple transgenic testing element and the ratio of gene copy number for each element and soybean is 1∶ 1． Key words： genetically modified roundup ready soybean； plasmid reference material； uncertainty evaluation
L-1-R GCCCATCTGCAAGCCTTTTT
L-1-P
FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACTAMRA
（ 4） 适用性考察。梯度稀释质粒 DNA 标准物质， 浓度从（ 106 ～ 100 ） copies / μL，以梯度稀释的质粒 DNA 标准物质 为 模 板 进 行 qPCR 扩 增。每 个 反 应 重 复 3 次，根据不同浓度模板扩增的 Ct 值与浓度之间的关 系，建立标准曲线。
快速梯度 PCR 仪 （ Bio-rad） ； 实时荧光定量 PCR 仪（ Life technologies） ； 微量核酸蛋白定量仪（ Nanodrop 2000） ； 电 泳 仪、电 泳 槽 （ BioRad ） ； 凝 胶 成 像 仪 （ BioRad） 。 1． 2 实验方法
（ 1） 质粒 DNA 分子的构建和提取。在数据库中 检索转基因通用元件的保守序列： 花椰菜花叶病毒 CaMV 35S 启动子（ 269 bp） 、NOS 终止子（ 256 bp） 、新 霉素磷酸转移酶基因 NPT Ⅱ（ 831 bp） 、玄参花叶病毒 FMV 35S 启动子（ 564 bp） ，人工合成并插入到质粒载 体 pcDNA3． 1 （ + ） 中，得到质粒 pLW09，设计引物序 列，提 取 大 豆 的 基 因 组 DNA，克 隆 大 豆 内 源 基 因 Lectin-1，并插入到质粒载体 pLW09，得到转基因大豆 检测质粒 pLW12。将构建的质粒转入大肠杆菌中，大 量提取质粒 DNA。
摘 要： 为了方便、快速地检测大豆及其加工食品中的转基因成分，准确定量转基
因大豆的转基因含量，构建含常用转基因插入元件花椰菜花叶病毒 CaMV35S 启动
子、NOS 终止子、新霉素磷酸转移酶基因 NPTⅡ、玄参花叶病毒 FMV35S 启动子和
大豆内源基因 Lectin-1 的质粒 DNA 标准物质，质粒 DNA 中靶基因元件均为单拷
表 1 转基因插入基因及植物内标准基因的引物及探针序列
基因 引物 /探针
序列（ 5’～ 3’）
CaMV35S CaMV35S-F CGACAGTGGTCCCAAAGA
CaMV35S-R AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC
FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCCaMV35S-P
第5 期
梁 文，等： 转基因大豆质粒 DNA 标准物质的研制
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0引言
转基因技术将基因在不同物种之间转移，改造生 物的遗传物质，使其在性状、营养品质、消费品质等方 面向人类所需要的目标转变，满足人类的各种需求，例 如提高产量、表达特殊营养成分甚至获得抗除草剂抗 病毒或抗虫害的能力［1-3］。但是，随着转基因作物在全 世界范围内的广泛种植，其食用安全和环境安全问题 也引起了广大消费者和各国政府及相关机构人员的重 视［4-5］。转基因成分检测已成为各国转基因产品监管 的重 要 部 分。 qPCR 是 转 基 因 核 酸 检 测 的 主 要 方 法［6-7］。转 基 因 作 物 中 常 用 的 插 入 元 件 CaMV35S、 NOS、NPTⅡ、FMV35S 常作为靶标基因，用于鉴定转基 因成分和 含 量［8-10］，而 转 基 因 大 豆 内 源 基 因 Lectin-1 由于保守性强，常作为大豆内标准靶标基因［11］。
收稿日期：2015 － 08 － 06 基金项目：国家质检公益性行业科研专项（ 201310016） ； 上海市计量 测试技术研究院项目（ HOORY1406）
作者简介：梁 文 （ 1986 － ） ，女，四川德阳人，硕士，工程师，主要研 究方向为生物计量。
Tel． ： 021-38839800* 35350； E-mail： liangw@ simt． com． cn
（ 5） 均匀性分析。方差分析法是用来统计检验均 匀性的最常用方法，是通过组间、组内方差的比较来判 断各组测量值之间有无系统性差异，如果两者的比小 于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的［14］。
具体方法： 从质粒 DNA 标准物质中随机抽取 15 瓶； 对所取每个样品取样 3 次，每次取样量为 5 μL。 每个取样量用 qPCR 法进行重复测定，将外源转基因 元件 CaMV35S 和大豆内标准基因扩增得到的 Ct 值相 比后，对测定结果用方差分析法 （ F-检 验 法） 进 行 统 计，判断均匀性检验结果。
中图分类号：Q 819
文献标志码：A
文章编号：1006 － 7167（ 2016） 05 － 0018 － 04
Development of a Plasmid DNA Reference Material for PCR Analysis of Genetically Modified Roundup Ready Soybean
1 实验材料与实验方法
1． 1 试剂及仪器 基因组提取试剂盒 （ OMEGA） ； 质粒提取试剂盒
（ OMEGA） ； 限制性内切酶、λ-Hind III DNA Marker（ 宝 生物 工 程 有 限 公 司 ） ； 质 粒 载 体 pcDNA3． 1 （ + ） （ Invitrogen） ，全基因人工合成、引物合成（ 宝生物工程 有限公司） ； 转基因大豆粉末标准物质（ ERM-410gk） ； 其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
（ 2） 质粒 DNA 纯度的验证。用紫外分光光度法
测定 DNA 在 A230 ，A260 ，A280 处 的 吸 光 值。纯 DNA 的 A260 / A280 应为 1． 8 ～ 2． 0［12］，而 A260 / A230 应达到 2． 0。用 凝胶电泳图像分析法鉴定单酶切前后的质粒分子。
（ 3） 实时荧光定量 PCR 引物探针和程序。参考 已报道的 检 测 4 种 转 基 因 元 件 和 大 豆 内 标 准 基 因 Lectin-1 的引物探针［13］，并根据 PCR 的扩增效率对引 物探针进行优化，序列详见表 1。PCR 扩增程序为： 95 ℃ ，10 min； 95 ℃ ，15 s； 60 ℃ ，1 min； 40 个循环。