毛细管电泳化学发光检测研究新进展

毛细管电泳化学发光检测研究新进展1

吉邢虎，徐秦峰，何治柯*

武汉大学化学与分子科学学院，武汉 (430072)

E-mail：zhkhe@

摘要：分析技术的微型化、集成化和自动化是当前分析化学发展的一个新趋势。本文综述了毛细管电泳化学发光检测系统微型化、集成化和自动化的最新研究进展。

关键词：毛细管电泳，化学发光检测，微型化，集成化，自动化

中图分类号：O657.8

1．引言

自1990年Manz等[1,2]提出“微全分析系统”（Micro total analysis system, µ- TAS）概念以来，分析技术的微型化、集成化和自动化成为分析化学发展的一个新趋势。分析仪器微型化、集成化带来的分析性能的全面提升为当前科研工作者所瞩目。但µ-TAS的技术平台－微流控分析芯片的制作加工程序复杂，操作技术难度大，设备成本高，实现普通研究工作室的全面普及还有很长的距离。如何实现已成熟的分析方法的微型化、集成化，以提高其分析性能，达到全面普及的要求，也成为当前科研工作的一个研究热点。

毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）与化学发光（Chemiluminescence，CL）的结合（CE-CL），兼备了毛细管电泳分离效率高和化学发光灵敏度高的优点，直接用于复杂样品中微量组分的分离与测定，可同时解决选择性差和灵敏度低的问题，给化学发光研究和毛细管电泳技术提供了发展机会[3-5]。1991年Hara等[6]首次将化学发光检测应用于毛细管电泳分析。经过十多年的发展，CE-CL不断突破联用接口技术难关[4]，技术优势不断突现，发展速度相当快。不同特性的化学发光体系，包括鲁米诺[7-13]、过氧草酸酯[6,14-17]、吖啶酯[18-20]、钌配合物[21-29]、高锰酸钾[30-32]等已在CE-CL中获得成功使用，用于测定金属离子、蛋白质、氨基酸及其衍生物、H2O2或多环芳烃等物质。在此基础上，毛细管电泳化学发光检测系统的微型化、集成化和自动化也取得了一定进展。

2．微型化

Tsukagoshi等[33]将柱端液池式CE-CL检测装置微型化（图1A），以模拟芯片毛细管电泳化学发光检测系统（Microchip-based CE-CL, MCE-CL）[34]（图1B）。50 µm内径的毛细管用聚乙烯管连接形成类似于微流控芯片的十字交叉进样通道。交叉点到R4的毛细管长30 mm，其余毛细管长度为10 mm，尺寸基本与微芯片相当。以四个硅胶管做为储液池，金属离子样品溶液放入R1，鲁米诺电泳缓冲溶液分别放入R2和R3，氧化剂H2O2放入R4，光电倍增管（PM）置于R4的底部用于化学发光检测。在R1和R2间施加电压使样品进入交叉区域，进样结束后在R3和R4间施加电压实现电泳分离。为防止样品的泄漏，进样和分离时采用了芯片毛细管电泳的夹流进样方式[35]。在上述实验操作条件下，完成了Co(II)，Cu(II)，Ni(II)三种金属离子的分析检测，对Co(II)的检测范围为1×10-7~1×10-6 mol/L。与芯片毛细管电泳的检测结果相比，浓度检测限可低1~2个数量级，可能原因在于该装置下的进样量比芯片的进样量多；但微芯片的质量检测限却可达到0.4 fmol。该装置可以完全模拟芯片毛细管电泳化学发光检测的全过程，而且容易操作，可更改性很强。作者认为该仪器装

1本课题得到教育部博士点基金（20050486026）的资助。

置同样符合µ-TAS的概念。

图1 微型化CE-CL(A)[33]与MCE-CL(B)[34]比较

Hashimoto等将光纤引入液池式[36]和流通式[37]毛细管电泳化学发光检测系统，以简化仪器结构。实验中采用聚四氟乙烯材料制作化学发光检测池（图2 A和B），既充当检测池的作用，又作为柱后电泳液的储液池。毛细管末端1~2 mm的聚酰亚胺涂层被烧去后，与接地电极和光导纤维分别固定于检测池上相应位置，结构如图2所示。其中（A）检测池含有两根光纤，与毛细管成直角方向放置；（B）检测池中只有一根光纤，正对毛细管的出口放置。两检测池中接地电极均置于距中心8 mm远的位置。以鲁米诺-H2O2-K3Fe(CN)6化学发光反应体系为模型，考察了两检测池的检测效果。结果表明，（B）检测池对鲁米诺的灵敏度比（A）检测池高出近100倍。原因在于，（A）检测池中电泳分离出来的鲁米诺阻力较小，迅速穿过两光纤的间隙，试剂混合效率低，反应不完全；（B）检测池中电泳分离的鲁米诺直接碰撞光纤的横截面，混合效果好，反应完全，灵敏度高。在（B）检测池的模式下，有微过氧化物酶参与的化学发光反应体系中，鲁米诺的检测限可达1.7×10-9 mol/L。该检测池用于异鲁米诺异硫氰酸酯（ILITC）标记的甘氨酸及其形成的小肽，均可达到基线分离检测。而且该检测池易于与毛细管电泳装置结合，实验操作过程也不繁琐，有望成为CE的一种实际的化学发光检测系统。在流通式化学发光检测器中（图2 C），1 mm直径的光导纤维正对聚四氟乙烯化学发光反应管内分离毛细管出口放置，间距0.5 mm。接地电极从光导纤维所在三通接入构成电泳电场回路，H2O2由注射泵经分离毛细管侧三通泵入化学发光反应区

图2 采用光纤的液池式(A，B)[36]和流通式(C)[37]CE-CL检测器

域。在优化的实验条件下，该流通式化学发光检测池对鲁米诺的检测限达到7.6×10-9 mol/L ，理论塔板数高达130000~160000，为文献报道中分离效率的最好结果。

Tsukagoshi 等[38]报道了一种高度集成化的毛细管电泳化学发光检测装置（图3）。整个装置都由聚四氟乙烯材料做成，体积60 mm ×40 mm ×30 mm ，仅有手掌尺寸大小，可与微全分析系统相媲美。集成装置包括样品池、电泳缓冲溶液池和化学发光检测池三个储液池，两根电泳电极以及一根用于发光检测的光导纤维。分离通道可采用10 cm 长的石英毛细管或者聚四氟乙烯管，避免了微流控分析芯片通道可能堵塞等不必要麻烦，而且毛细管可任意修饰、随时更换。该装置不仅可用于ILITC 的分离分析，而且利用ILITC 标记的人血清白蛋白（HSA ）和分析物HAS 同试样池内固定了HSA 抗体的玻璃微珠之间的竞争性免疫反应，通过测定ILITC-HSA 的信号，可实现HSA 的在线免疫分析测定。 通常，毛细管电泳化学发光检测采用柱端模式。最近，Zhang

等[39]报道了毛细管电泳在柱（on-capillary ）化学发光检测模式，工作原理如图4所示。在距毛细管入口端50 cm 的地

方去除约4 cm 长聚酰亚胺涂层，形成透明的检测窗口，固定窗口两端以防毛细管折断。采用脉冲激光器在50.5 cm 处的毛细管壁打出直径为30 µm 的小孔，用于化学发光试剂进入分离毛细管，与电泳分离组分在毛细管内发生反应，产生化学发光信号，即实现了零死体积的毛细管电泳在柱化学发光检测。实验中，以pH 10.8磷酸盐溶液作为电泳缓冲液，在进样端加入Cu(II)离子作为催化剂，在小孔处加入H 2O 2。鲁米诺与氨基丁基乙基异鲁米诺（ABEI ）进样电泳分离后，与经小孔进入毛细管的氧化剂H 2O 2反应，在小孔下游1~1.2 cm 处产生最

图3 集成化CE-CL 检测装置示意图[38]

图4 毛细管电泳在柱化学发光检测原理示意图[39]