基因工程分子克隆载体

本章思考题： 1.列举质粒载体必须具备的4个基本特性。 2.什么叫穿梭载体？ 3. M13系列载体具有哪些优缺点? 4.黏粒载体具有哪些特点与不足? 5.质粒如何维持在细胞中的稳定？ 主要参考资料: 1.吴乃虎主编. 基因工程原理(第二版) .北京:科学出版 社,2002. 2.陆德如,陈永青主编．基因工程.化学工业出版社,2002 3.马建岗主编.基因工程学原理. 西安:西安交通大学出版 社,2001 4. [美] 本杰明∙卢因编著.基因Ⅷ.北京:科学出版社,2007.
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子 遗传学观点来看是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式， 是生命起源研究的一块重要基石。 2）实践意义 是基因工程的重要载体，能把外源基因（目的 基因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
①质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要 任务之一就是严格改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个 致癌质粒可以传递就会传到外都是。 ②作为基因工程载体的3个特点：
要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因） 通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工 具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具 就叫做载体（vector）。 载体: 能与外源DNA片断结合并将之传递到受体细胞而使之
复制表达的传递者。包括质粒、噬菌体、粘粒载体、 病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。 载体的功能：1、 运送外源基因高效转入受体细胞；
A.都能独立自主的复制； B.都能便利的加以检测（抗生素抗性）； C.都能容易引进宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化 （提质粒）。 基因工程中主要使用人工构建的质粒。
1、自主复制性
质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控 制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体 DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不 同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制 酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的 多种酶群。
3、具有能够观察的表型特征(有报告墓因)，在插入外源 DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。即容 易将带有外源DNA的重组体与不带外源DNA的载体区别 开来。
4、具有较高的拷贝数，便于载体的制备。
5、易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。
6、在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而 不易丢失。
严谨控制机理（低拷贝原因），认为 是该质粒可以产生阻遏蛋白，反馈抑 制自身DNA合成。
基因工程使用松弛型（高拷贝数） 质粒，以获得列多的基因产物。
*拷贝数（copy number)—细胞所含的按每一基因组计算的某种 质粒或基因的数目。
3、不相容性
利用同一复制系统的不同质粒如果被导入同一细胞中， 它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争， 它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快， 结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有 占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留 在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时,称之为共
价闭合环形DNA(cccDNA)这样的
DNA通常呈现超螺旋的SC构型(c); 切割
连接
如果两条多核苷酸链中只有一条保
持着完整的环形结构，另一条链出
现有一至数个缺口时，称之为开环
DNA(ocDNA)，此即OC构型(b);若
质粒DNA经过适当的限制性核酸内 切割
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
Baidu Nhomakorabea
2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
2、 为外源基因提供复制能力或整合能力； 3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
基因工程中的载体应具有如下一些特性:
1、能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在其 DNA中插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和 遗传特性。
2、在其DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点(最好是 单一酶切位点)，这些位点位于DNA复制的非必需区内， 可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载 体自身 DNA的复制。
连接
切酶切割之后，发生双链断裂而形
成线性DNA(IDNA)，通称L构型(a) 。
质粒与宿主细胞的关系
（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借 居”
宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响， 宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶 和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿 主细胞的补偿（“交房租”）。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关 的，如抗生素抗性基因。