高效液相色谱分析法 HPLCPPT课件
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2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等）
3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。
4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。
6
§2-2 基本理论和条件选择
基础 热力学理论：塔板理论——平衡理论 理论 动力学理论：速率理论——Vander方程
堆积硅珠 YQG 3~4 μm
A2dp
A dp
B2Dm2Dg BtR， BDg
Dg T或Dg
T M
C C mC sC gC l C l
Cl
df 2 Dl
DL
T
8
2. HPL： CHACu （忽略纵向扩散项后）
B2Dm
T Dm
柱T温 低，流 大 动 B相忽略
➢ 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）
u1cm /s时H ， u
H： P H A L C m C u C s m u
Cm
Csm
dp2 Dm
dp 2 C
Dm
Dm
T
d p C H， n 柱 效
D m H ， n柱 效
TDm C，但易产生气泡
TDm ，，柱阻
11
12
三、 影响分离的因素
1 R n1 k2 ． 4 1k2
HACu n ：采用粒度小、填匀 充的 均固定相 采用粘度小、低流流 速动 的相
3
2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用
力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用
力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
1
概述
1
点击输入简要文字内容，文字内容需概括精炼，不用多余 的文字修饰，言简意赅的说明分项内容……
2
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3
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2
一、HPLC与GC差别 1．分析对象的区别
第三章 高效液相色谱分析法 HPLC
（High Pertormance Liquid Chromatography，）
§2-1 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。
它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
15
一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
tR t0(1KVSm) kK S Vm
分离前提：K不等或k不等
16
2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）
（1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）
全多孔硅胶 无定形 YWG 球形 YQG
2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 约1ml/min
3. 柱温的选择： 选室温250C左右
14
§2-3 各类高效液相色谱法简介
一、液固吸附色谱法（LSC）
(liquid-solid adsorption chromatography)
二、液液分配色谱法（LLC）
(liquid-liquid partition chromatography,
chemical bonded phase chromatography
三、离子色谱法（IC）
（ion-exchange chromatography and
ion pair chromatography)
四、空间排阻色谱法（SEC）
（ steric exclusion chromatography
K2 k2 tR' 2 VR'2
K1 k1 tR' 1 VR'1
：调整流动相种 质类 和、 固性 定相性质 温（ 影受 响柱 小
kWs CsVs KVs tR '
Wm CmVm
Vm t0
k ：调整流动相和固 的定 配相 比（受柱温影 小响 ）较
13
四、HPLC法中分离条件的选择
1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱
一、塔板理论
H理L/n理 n理(tR)25.5(4 W t1 R2)21(6 W tR)2
Heff L/neff
neff16(W tR ' )2
5.54( tR ' )2 W12
k
t
' R
t0
neff n理(1kk)2
7
二、速率理论（与GC对比）
1.
GC：HAB/uCu （填充柱）
或 H B/u Cu （毛细管柱）
GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20%
HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
4
二、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质）
2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
5
三、HPLC的特点和实际应用
1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质----生化物质。
wk.baidu.com
u H， n 柱 效 ，tR 但
兼顾柱效和分选 析择 时 u1间 ml/， min
2）涡流扩散项及其影响
A2dp
A dp
， d p A H ， n柱 效 9
10
3）传质阻抗项及其影响
CCmCsmCs CmCs（ m 忽略固定相 ）传 注：只考虑流动相态 和流 静动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。
4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。
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§2-2 基本理论和条件选择
基础 热力学理论：塔板理论——平衡理论 理论 动力学理论：速率理论——Vander方程
堆积硅珠 YQG 3~4 μm
A2dp
A dp
B2Dm2Dg BtR， BDg
Dg T或Dg
T M
C C mC sC gC l C l
Cl
df 2 Dl
DL
T
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2. HPL： CHACu （忽略纵向扩散项后）
B2Dm
T Dm
柱T温 低，流 大 动 B相忽略
➢ 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）
u1cm /s时H ， u
H： P H A L C m C u C s m u
Cm
Csm
dp2 Dm
dp 2 C
Dm
Dm
T
d p C H， n 柱 效
D m H ， n柱 效
TDm C，但易产生气泡
TDm ，，柱阻
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三、 影响分离的因素
1 R n1 k2 ． 4 1k2
HACu n ：采用粒度小、填匀 充的 均固定相 采用粘度小、低流流 速动 的相
3
2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用
力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用
力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
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概述
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一、HPLC与GC差别 1．分析对象的区别
第三章 高效液相色谱分析法 HPLC
（High Pertormance Liquid Chromatography，）
§2-1 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。
它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
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一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
tR t0(1KVSm) kK S Vm
分离前提：K不等或k不等
16
2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）
（1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）
全多孔硅胶 无定形 YWG 球形 YQG
2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 约1ml/min
3. 柱温的选择： 选室温250C左右
14
§2-3 各类高效液相色谱法简介
一、液固吸附色谱法（LSC）
(liquid-solid adsorption chromatography)
二、液液分配色谱法（LLC）
(liquid-liquid partition chromatography,
chemical bonded phase chromatography
三、离子色谱法（IC）
（ion-exchange chromatography and
ion pair chromatography)
四、空间排阻色谱法（SEC）
（ steric exclusion chromatography
K2 k2 tR' 2 VR'2
K1 k1 tR' 1 VR'1
：调整流动相种 质类 和、 固性 定相性质 温（ 影受 响柱 小
kWs CsVs KVs tR '
Wm CmVm
Vm t0
k ：调整流动相和固 的定 配相 比（受柱温影 小响 ）较
13
四、HPLC法中分离条件的选择
1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱
一、塔板理论
H理L/n理 n理(tR)25.5(4 W t1 R2)21(6 W tR)2
Heff L/neff
neff16(W tR ' )2
5.54( tR ' )2 W12
k
t
' R
t0
neff n理(1kk)2
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二、速率理论（与GC对比）
1.
GC：HAB/uCu （填充柱）
或 H B/u Cu （毛细管柱）
GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20%
HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
4
二、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质）
2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
5
三、HPLC的特点和实际应用
1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质----生化物质。
wk.baidu.com
u H， n 柱 效 ，tR 但
兼顾柱效和分选 析择 时 u1间 ml/， min
2）涡流扩散项及其影响
A2dp
A dp
， d p A H ， n柱 效 9
10
3）传质阻抗项及其影响
CCmCsmCs CmCs（ m 忽略固定相 ）传 注：只考虑流动相态 和流 静动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗