丙二醛的测定

丙二醛的测定
一、试剂：
(1) TBA水溶液：准确称取TBA0.288g溶于水中，并稀释至100ml（如TBA不易溶解，可加热至全溶澄清，然后稀释至100ml），相当于0.02M；
(2) 三氯乙酸混合液：准确称取三氯乙酸（分析纯）7.5g及0.1gEDTA，用水溶解，稀释至100ml；
(3)氯仿（分析纯）；
(4)丙二醛标准溶液：称取0.315g1，1，3，3-四乙氧基丙烷，溶解后稀释至1000ml，此溶液每ml相当于丙二醛100μg，置于冰箱内保存。

准确吸取1ml，稀释至100ml，此溶液每ml相当于丙二醛1μg，备用。

操作步骤
（1）标准曲线的绘制
准确吸取每ml相当于丙二醛1μg的标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml置于纳氏比色管中，加水至总体积为1ml，加入4mlTBA溶液，然后按样品测定步骤进行，测得光密度绘制标准曲线。

（2）样品制备与检测
准确称取均匀的豆油15g，置于100ml有盖三角瓶内，加入25ml三氯乙酸混合液，振摇半小时（保持油脂融溶状态，如冷结即在70℃水浴上略微加热使之融化后继续振摇）用双层滤纸过滤，除去油脂。

滤液重复用双层滤纸过滤一次。

准确移取上述滤液10ml置于25ml比色管内，加入10mlTBA溶液，混匀，加塞，置于90℃水浴内保温40min，取出，冷却1h，移入小试管内，离心5min，上清液倾入25ml纳氏比色管中，加入5ml氯仿，摇匀，静置，分层，吸出上清液于532nm波长处，用2cm比色皿比色（同时作空白试验）。

4.计算
光密度 (A532/kg)=
丙二醛含量（mg/Kg）=
[材料、仪器、药品]
1．材料：植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。

2．仪器：(1) 分光光度计；(2) 离心机；（3）水浴锅：(4) 天平；(5) 研钵；(6) 剪刀；(7) 5ml刻度离心管；(9) 刻度试管(10ml)；(10) 镊子；(11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。

3．药品：(1) 0.05mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液；(2) 石英砂；(3) 5％三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml；(4) 0.5％
硫代巴比妥酸溶液：称取0.5g硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至100ml，即为0.5％硫代巴比妥酸的5％三氯乙酸溶液。

[方法]
1．丙二醛的提取：取0.5g样品，加入2ml预冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。

在4500转/min离心10min。

上清液即为丙二醛提取液。

2．丙二醛含量测定：吸取2 ml的提取液于刻度试管中，加入0.5％硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml，于沸水浴上加热10min，迅速冷却。

于4500转/min 离心10min。

取上清液于532、600nm波长下，以蒸馏水为空白调透光率100%，测定吸光度。

3．结果计算：(A532—A600) ×V1×V
1.55×10-1×W×V2
丙二醛含量（nmol/g）=
式中：A为吸光度；V1为反应液总量(5m1)；V为提取液总量(5ml)；V2为反应液中的提取液数量(2ml)；W为植物样品重量(0.5g)；1.55×10-1为丙二醛的微摩尔吸光系数（在1升溶液中含有1µmol丙二醛时的吸光度）。

4．注意事项：
(1) 0.1~0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；
(2) MDA—TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10~15min之间。

时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；
(3) 如用MDA作为植物衰老指标，首先应检验被测试材料提取液是否能与TBA
反应形成532nm处的吸收峰。

否则只测定532、600nm两处A值，计算结果与实际情况不符，测得的高A值是一个假象；
(4) 在有糖类物质干扰条件下(如深度衰老时)，吸光度的增大，不再是由于脂质过氧化产物MDA含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改变了提取液成分，不能再用532nm、600nm两处A值计算MDA含量，可测定510、532、560nm 处的A值，用A532一(A510—A560)/2的值来代表丙二醛与TBA反应液的吸光值。