鱼类的急性毒性实验
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在24h、48h、72h、96h后检查受试鱼的状况。如果 没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄后无反 应等，即可判断该鱼已死亡。观察并记录死鱼数目后，将 死鱼从容器中取出。应在试验开始后3h或6h观察各处理组 鱼的状况，并记录试验鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去 平衡，游泳能力和呼吸能力减弱，色素沉积、受惊吓后运 动状况等）。 试验开始和结束时要测定pH、溶解氧和温度。试验期 间，每天至少测定一次。 至少在试验开始和结束时，测定实验容器中试验液的 受试物浓度。 试验结束时，对照组的死亡率不得超过10％。
高毒
中等毒
低毒
微毒（无毒）
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3．编写报告 在实验报告中应包括：试验名称、目的、试验原理、 试验的准确起止日期，还有如下几项： （1）试验鱼的种名、来源、体重、体长、健康和驯 化状况。 （2）受试物质名称、来源物化性质和保存方法。 （3）实验用水的来源、物化性质和实验前的处理等。 （4）实验溶液的浓度与配置方法、实验温度。 （5）实验条件，如容器形式、实验液的体积与深度、 受试生物数目及负荷率。 （6）实验开始后24h、48h、72h、96h时的LC50值， 及其毒性分级。
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1．预实验 用确定正式实验所需浓度范围，可选择较大范围 的浓度系列，如1000mg/L、100mg/L、10mg/L、 1mg/L、0.1mg/L。每个浓度放入五条鱼，可用静态 方式进行，不设平行组，试验持续48～96h。每日至 少两次记录各容器内的死鱼数，并及时取出死鱼。求 出24h100％死亡浓度和96h无死亡浓度。 如果依次预试验结果无法确定正式试验所需的浓 度范围，应另选一浓度范围再次进行预试验。
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1．实验鱼的选择与驯养 试验用的鱼必须对毒物敏感，具有一定的代表性， 便于实验条件下饲养，来源丰富，个体健康。我国可 采用的试验鱼有四大养殖淡水鱼（青鱼、草鱼、鲢鱼 和鳙鱼）、金鱼、鲫鱼、野生的食蚊鱼等。本实验选 用鲫鱼作为实验鱼。 在同一实验中要求试验鱼必须同属、同种、同龄， 最好是当年生。鱼的平均体长以7cm以下为合适。金 鱼体短、身宽，一般以3cm以下较为合适。同组鱼中 最大的体长不应超过最小的体长的1.5倍。
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（2）pH 水的pH与水生生物的代谢作用有密切关系。对毒 物的毒性作用也有一定的影响。因此，在实验中应维 持pH在鱼类适宜范围内。一般实验液的pH在6.7～8.5 为宜。如需调节pH，可用1M或0.1M的HCl和NaOH来 调节受试物贮备液的pH。调节贮备液的pH时不能使 受试物浓度明显改变，或发生化学反应或沉淀。 （3）溶解氧 溶解氧是鱼类生存的必要条件，它能影响鱼类对 毒物的敏感性。一般温水鱼要求溶解氧在4mg/L以上， 冷水鱼要求溶解氧在 5mg/L以上。 （4）硬度 水的总硬度为 10～250 mg/L（以CaCO3计）。
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2．正式实验 根据预试验得出的结果，在包括使鱼全部死亡的最 低浓度和96 h鱼类全部存活的最好浓度之间至少设置5 个浓度组，并以几何级数排布。浓度间隔系数应≤2.2。 每个试验浓度组应至少设2～3个平行，每一系列设 一个空白对照。如使用了助溶剂，应增设溶剂对照组， 其浓度与试剂中的最高溶剂浓度相同。试验鱼的数目以 每组实验浓度10～20尾合适，不得少于10尾。 试验溶液调节至相应温度后，从驯养鱼群中随即取 出鱼并随机迅速放入各试验容器中。转移期间处理不当 的鱼均应弃除。同一试验，所有试验用鱼应30min内分 组完毕。
实验三 鱼类的急性毒性实验
指导老师：刘汝涛
山东大学环境科学与工程学院
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目的与要求
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实验步骤
2
3
实验原理
5
6
实验报告
实验材料
注意事项
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通过本实验，熟悉和掌握鱼类急性毒性试验的设 计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析 和报告等全过程。
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2．实验仪器设备 （1）实验容器 实验容器一般用玻璃或其他化学惰性材质制成的水族 箱或水槽。容器体积可根据试验鱼的体重确定，通常以每 升水中鱼的负荷不得超过2g（最好为1g）。一些小型鱼类 幼鱼可选择500mL或 1000mL烧杯为实验容器。容器的深 度必须超过16cm，水体表面积越大越好。同一实验应采用 相同规格和质量的容器。为防止鱼类跳出容器，可在容器 上加上网罩。实验容器使用后，必须彻底洗净，以除去所 有毒性残留物。 （2）其他 溶解氧测定仪、水硬度计、温度控制仪、pH计、分析 天平。 Company Logo
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实验用水的水质条件一般是指水的温度、pH、溶 解氧、硬度、水中的有机物和水量等。 （1）水温 实验中应保持鱼类原来的适应温度，一般冷水鱼 在12～18℃，温水鱼在20～28℃。为使得实验结果可 靠，在同一实验中，温度的波动范围不要超过4℃（即 ±2℃）。冬天可以通过加热室内的空气温度而达到调 节水温的目的，也可以采用电热棒直接控制调节水温。
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1．数据处理 以暴露浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，在计 算机或对数概率纸上，绘制暴露浓度对死亡率的曲 线。用直线内插法或常用统计程序计算出 24h、48h、 72h、96h的半致死浓度（LC50）值，并计算95％的 置信限。 如果试验数据不适于计算LC50，可用不引起死 亡的最高浓度和引起100％死亡的最低死亡浓度估算 LC50的近似值，即这两个浓度的集合平均值。
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（1）试验期间，对照组鱼死亡率不得超过10％。 （2）试验期间，受试物实测浓度不能低于设置浓度的 80％。如果试验期间受试物实测浓度与设置浓度相差超 过20％，则应该以实测受试物浓度来表达试验结果。 （3）试验期间，尽可能维持恒定条件。
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鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污 染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如 行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。 在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液， 实验至少进行24h，最好以96 h为一个实验周期，在24h、 48h、72h、96h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡 50％时的受试物浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水 环境质量中占重要地位。通过鱼类急性毒性试验可以评 价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应 表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定 化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理 的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理 废水排放提供环境依据。
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选用的试验鱼在试验前必须在实验室内经过驯养，使 之适应实验室条件的生活环境和进行健康选择。驯养鱼应 该与试验相同水质水温的水体中至少驯养7d，使其适应试 验环境，不应长期养殖（＜2个月）。驯养期间，应每天换 水，可每天喂食1-2次，但在试验前一天应停止喂食，以免 试验时，剩余饵料及粪便影响水质。驯养期间试验鱼死亡 率不得超过5％，否则，可以认为这批鱼不符合试验鱼的要 求，应该继续驯养或者重新更换试验鱼进行驯养。 试验前必须挑选健康的鱼，即选择体色光泽、鱼鳍完 整舒展、行动活泼、逆水性强、大小无太大悬殊、无任何 疾病的鱼作为试验鱼。任何畸形鱼、外观上反常态的鱼都 不得作试验鱼。
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2．化学物质急性毒性分级 依据LC50值的大小，可以将化学物质的急性毒性 分为剧毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5级，如实验 表3-1所示。
实验表3-1 鱼类急性毒性实验毒性分级标准
鱼起始LC50（mg/L） ＜1 毒性分级 剧毒
1～100 100～1000 1000～10000 ＞10000
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3．实验用水（稀释水）及水质条件 用来驯养和配置实验液的水，必须是未受污染的清 洁水。一般可采用天然河水、湖水或地下水，但需过滤 以除去大的悬浮物质。也可用自来水代替，但必须进行 人工曝气或放置3d以上脱氯。如果试验目的是评价工业 废水或化学物质对接纳水体的影响时，则最好采用接纳 水体的污染源上游水作为试验用稀释水。蒸馏水不适合 做稀释水，因为蒸馏水中已除去了自然界水中的盐类， 与实际差距太大，另外由于蒸馏器的影响，有时使蒸馏 水中带有对鱼类不利的金属离子，影响试验结果。
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在24h、48h、72h、96h后检查受试鱼的状况。如果 没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄后无反 应等，即可判断该鱼已死亡。观察并记录死鱼数目后，将 死鱼从容器中取出。应在试验开始后3h或6h观察各处理组 鱼的状况，并记录试验鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去 平衡，游泳能力和呼吸能力减弱，色素沉积、受惊吓后运 动状况等）。 试验开始和结束时要测定pH、溶解氧和温度。试验期 间，每天至少测定一次。 至少在试验开始和结束时，测定实验容器中试验液的 受试物浓度。 试验结束时，对照组的死亡率不得超过10％。
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3．编写报告 在实验报告中应包括：试验名称、目的、试验原理、 试验的准确起止日期，还有如下几项： （1）试验鱼的种名、来源、体重、体长、健康和驯 化状况。 （2）受试物质名称、来源物化性质和保存方法。 （3）实验用水的来源、物化性质和实验前的处理等。 （4）实验溶液的浓度与配置方法、实验温度。 （5）实验条件，如容器形式、实验液的体积与深度、 受试生物数目及负荷率。 （6）实验开始后24h、48h、72h、96h时的LC50值， 及其毒性分级。
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1．预实验 用确定正式实验所需浓度范围，可选择较大范围 的浓度系列，如1000mg/L、100mg/L、10mg/L、 1mg/L、0.1mg/L。每个浓度放入五条鱼，可用静态 方式进行，不设平行组，试验持续48～96h。每日至 少两次记录各容器内的死鱼数，并及时取出死鱼。求 出24h100％死亡浓度和96h无死亡浓度。 如果依次预试验结果无法确定正式试验所需的浓 度范围，应另选一浓度范围再次进行预试验。
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1．实验鱼的选择与驯养 试验用的鱼必须对毒物敏感，具有一定的代表性， 便于实验条件下饲养，来源丰富，个体健康。我国可 采用的试验鱼有四大养殖淡水鱼（青鱼、草鱼、鲢鱼 和鳙鱼）、金鱼、鲫鱼、野生的食蚊鱼等。本实验选 用鲫鱼作为实验鱼。 在同一实验中要求试验鱼必须同属、同种、同龄， 最好是当年生。鱼的平均体长以7cm以下为合适。金 鱼体短、身宽，一般以3cm以下较为合适。同组鱼中 最大的体长不应超过最小的体长的1.5倍。
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（2）pH 水的pH与水生生物的代谢作用有密切关系。对毒 物的毒性作用也有一定的影响。因此，在实验中应维 持pH在鱼类适宜范围内。一般实验液的pH在6.7～8.5 为宜。如需调节pH，可用1M或0.1M的HCl和NaOH来 调节受试物贮备液的pH。调节贮备液的pH时不能使 受试物浓度明显改变，或发生化学反应或沉淀。 （3）溶解氧 溶解氧是鱼类生存的必要条件，它能影响鱼类对 毒物的敏感性。一般温水鱼要求溶解氧在4mg/L以上， 冷水鱼要求溶解氧在 5mg/L以上。 （4）硬度 水的总硬度为 10～250 mg/L（以CaCO3计）。
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2．正式实验 根据预试验得出的结果，在包括使鱼全部死亡的最 低浓度和96 h鱼类全部存活的最好浓度之间至少设置5 个浓度组，并以几何级数排布。浓度间隔系数应≤2.2。 每个试验浓度组应至少设2～3个平行，每一系列设 一个空白对照。如使用了助溶剂，应增设溶剂对照组， 其浓度与试剂中的最高溶剂浓度相同。试验鱼的数目以 每组实验浓度10～20尾合适，不得少于10尾。 试验溶液调节至相应温度后，从驯养鱼群中随即取 出鱼并随机迅速放入各试验容器中。转移期间处理不当 的鱼均应弃除。同一试验，所有试验用鱼应30min内分 组完毕。
实验三 鱼类的急性毒性实验
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2．实验仪器设备 （1）实验容器 实验容器一般用玻璃或其他化学惰性材质制成的水族 箱或水槽。容器体积可根据试验鱼的体重确定，通常以每 升水中鱼的负荷不得超过2g（最好为1g）。一些小型鱼类 幼鱼可选择500mL或 1000mL烧杯为实验容器。容器的深 度必须超过16cm，水体表面积越大越好。同一实验应采用 相同规格和质量的容器。为防止鱼类跳出容器，可在容器 上加上网罩。实验容器使用后，必须彻底洗净，以除去所 有毒性残留物。 （2）其他 溶解氧测定仪、水硬度计、温度控制仪、pH计、分析 天平。 Company Logo
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实验用水的水质条件一般是指水的温度、pH、溶 解氧、硬度、水中的有机物和水量等。 （1）水温 实验中应保持鱼类原来的适应温度，一般冷水鱼 在12～18℃，温水鱼在20～28℃。为使得实验结果可 靠，在同一实验中，温度的波动范围不要超过4℃（即 ±2℃）。冬天可以通过加热室内的空气温度而达到调 节水温的目的，也可以采用电热棒直接控制调节水温。
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1．数据处理 以暴露浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，在计 算机或对数概率纸上，绘制暴露浓度对死亡率的曲 线。用直线内插法或常用统计程序计算出 24h、48h、 72h、96h的半致死浓度（LC50）值，并计算95％的 置信限。 如果试验数据不适于计算LC50，可用不引起死 亡的最高浓度和引起100％死亡的最低死亡浓度估算 LC50的近似值，即这两个浓度的集合平均值。
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（1）试验期间，对照组鱼死亡率不得超过10％。 （2）试验期间，受试物实测浓度不能低于设置浓度的 80％。如果试验期间受试物实测浓度与设置浓度相差超 过20％，则应该以实测受试物浓度来表达试验结果。 （3）试验期间，尽可能维持恒定条件。
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鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污 染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如 行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。 在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液， 实验至少进行24h，最好以96 h为一个实验周期，在24h、 48h、72h、96h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡 50％时的受试物浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水 环境质量中占重要地位。通过鱼类急性毒性试验可以评 价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应 表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定 化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理 的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理 废水排放提供环境依据。
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选用的试验鱼在试验前必须在实验室内经过驯养，使 之适应实验室条件的生活环境和进行健康选择。驯养鱼应 该与试验相同水质水温的水体中至少驯养7d，使其适应试 验环境，不应长期养殖（＜2个月）。驯养期间，应每天换 水，可每天喂食1-2次，但在试验前一天应停止喂食，以免 试验时，剩余饵料及粪便影响水质。驯养期间试验鱼死亡 率不得超过5％，否则，可以认为这批鱼不符合试验鱼的要 求，应该继续驯养或者重新更换试验鱼进行驯养。 试验前必须挑选健康的鱼，即选择体色光泽、鱼鳍完 整舒展、行动活泼、逆水性强、大小无太大悬殊、无任何 疾病的鱼作为试验鱼。任何畸形鱼、外观上反常态的鱼都 不得作试验鱼。
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2．化学物质急性毒性分级 依据LC50值的大小，可以将化学物质的急性毒性 分为剧毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5级，如实验 表3-1所示。
实验表3-1 鱼类急性毒性实验毒性分级标准
鱼起始LC50（mg/L） ＜1 毒性分级 剧毒
1～100 100～1000 1000～10000 ＞10000
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3．实验用水（稀释水）及水质条件 用来驯养和配置实验液的水，必须是未受污染的清 洁水。一般可采用天然河水、湖水或地下水，但需过滤 以除去大的悬浮物质。也可用自来水代替，但必须进行 人工曝气或放置3d以上脱氯。如果试验目的是评价工业 废水或化学物质对接纳水体的影响时，则最好采用接纳 水体的污染源上游水作为试验用稀释水。蒸馏水不适合 做稀释水，因为蒸馏水中已除去了自然界水中的盐类， 与实际差距太大，另外由于蒸馏器的影响，有时使蒸馏 水中带有对鱼类不利的金属离子，影响试验结果。