绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达

背景知识

绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅

和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。 1996 年 GFP 的晶体结构被解

出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中

心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光

活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内

部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 .

实验一质粒DNA 的分离与纯化

一、实验目的

掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。该法用

于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的

质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。

二、基本原理

质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到

200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地

整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多

数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制

10-200 个拷贝。当宿主细胞的蛋白

时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。

质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒 DNA 用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。

质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒 DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒 DNA 的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒 DNA 的分离；质粒 DNA 的纯化。

1、细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒（如 pUC 系列）来说，只要将培养物放到标准的 LB 或 2YT 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒 DNA 。但对于严谨型质粒（如 pBR322 ）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。

2、菌体的收集、裂解和质粒DNA 的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株） DNA 与质粒 DNA 之间的两种主要性质差异：（ 1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA 大得多。（ 2）从细胞中提取得

到的大肠杆菌 DNA 主体是变性的线性分子，而大多数质粒 DNA 是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和NaOH 使菌体

裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时（如加入酸性的 NaAc 或 Kac 中和碱性 NaOH ），质粒 DNA 链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体 DNA 与变性蛋白质、 RNA 分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。

3、质粒 DNA 的提纯

胶电泳中不同构型的同一种质粒 DNA ，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在

最前沿的是 SC DNA ，其后依次是 L DNA 和 OC DNA 。

三、实验材料、仪器及试剂

1. 在含有 pEGFP －N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种， 置于含有 5mL LB 培养基

的试管中。 摇晃过夜。 （DH5α是一种大肠杆菌的诱变菌株，主要表现对外源 D NA 的免疫缺乏，是用

于基因工程的菌种）

在含有 pET-28a 质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。

2、使用仪器 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱

四、实验步骤

1. 取1.5ml DH5 α培养液倒入 1.5mL eppendorf 管（一种离心管） 中, 13000rpm 离心1min 。

对于小量制备的质粒 DNA ，经过苯酚抽提、 蛋白质及 RNA ，达到纯化的目的。

质粒 DNA 分子具有三种构型：共价闭合

环形 构型）和线性分子（ L 构型）。在细RNA 酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残

余

DNA （cccDNA ，SC 构型）、开环 DNA （ OC

2. 重复 1。

3.弃上清 ,将管倒置于卫生纸上数分钟 ,使液体流尽。

4.菌体沉淀重悬浮于 100 μL溶液Ⅰ中（需剧烈振荡）, 室温下放置 10min。

（溶液I ，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA ，pH 8.0 ；溶液I的作用；mM为mmol/L。

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当 pH值的 Tris-Cl 溶液。50

mM葡萄糖最大的好处是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是 Ca2+和Mg2+等二

价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物

生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。）

5.加入新配制的溶液Ⅱ 200μ l, 盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管5次 ,以混

匀内容物（千万不要振荡）,冰浴 5min 。

（溶液 II ，0.2 M NaOH / 1% SDS ；溶液 II 的作用；这是用新鲜的 0.4 N 的NaOH和2％的 SDS等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH稀释制备 0.4N的NaOH，保证 NaOH没有吸收空气中的 CO2而减弱碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为碱性条件下基因组 DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA也会断裂。）

6.加入 150 μL预冷的溶液Ⅲ ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次 ,使沉淀混匀 ,冰浴中 15分