超高效液相色谱法同时测定柑橘中11种类黄酮物质_冉玥

柑橘有丰富的营养价值和独特的感官品质，其果实 及果汁是世界消费最多的水果产品之一。柑橘果实中含 有大量的类黄酮、类胡萝卜素、维生素、酚酸等多种生 理活性物质，还含有几乎只存在于柑橘属中的多甲氧基 黄酮如川皮苷、桔黄酮等[1]。研究表明类黄酮物质具有抗 炎活性
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及原产地识别的依据[6-7]。Sentandreu等[8]研究了利用类黄 酮组成及其含量并结合多元统计判别分析方法可识别不 同种类柑橘汁，结果显示，黄芩素与川皮苷含量比例与 多甲氧基黄酮总含量可作为区分不同品种柑橘汁的特征 性成分，能够显著地将7种柑橘汁区分开来。 目前已有不少柑橘类黄酮检测的方法报道，其中 普通高效液相色谱法 [9-13] 为主流的分析方法，还存在分 析耗时长、测定的类黄酮化合物种类较少、精确度不 高等问题。而超高效液相色谱法(ultra performance liquid
，
现已广泛应用于食品、药物中各类物质的分析检测中。 比较了高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)和UPLC同时分离9种类黄酮物质 的效果，结果表明， UPLC 所用时间短 2.5 倍，使用溶剂 少5.5倍，而分离度却高1.7倍。目前国内较少有超高效液 相检测柑橘中类黄酮的方法报道。本研究采用正交试验 优化样品前处理方法，确定最佳仪器分析条件，建立超 高效液相色谱-二极管阵列检测器法同时测定柑橘中11种 类黄酮物质的方法。 1 1.1 材料与方法
要： 通过正交试验优化样品前处理条件，建立超高Fra Baidu bibliotek液相色谱快速检测柑橘中 11 种类黄酮物质的方法。
以甲醇 - 乙酸溶液为流动相，梯度洗脱， 8 种黄烷酮和 3 种多甲氧基黄酮 11min 内完全基线分离 ( 检测波长 283nm 和 330nm)。方法检出限为0.005～0.02mg/kg(RSN=3)，线性方程的相关系数均达到0.9993以上。果皮和果汁的回收率分 别为94.6%～100.2%，94.5%～101.8%；相对标准偏差(n=6)分别为1.1%～3.7%，0.9%～3.9%。该方法快速、高效、 低成本、环境友好、结果准确可靠，能满足柑橘中类黄酮化合物的检测要求。 关键词：超高效液相色谱；柑橘；类黄酮；正交试验
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食品科学
※分析检测
超高效液相色谱法同时测定柑橘中 11种类黄酮物质
冉 玥1,2，焦必宁1,2,*，赵其阳2，田 玲2，苏学素3，曾朝波3
400716) (1.西南大学食品科学学院，重庆 西南大学柑橘研究所，重庆 摘 400715；2.农业部柑橘产品质量安全风险评估实验室， 400712；3.西南大学化学化工学院，重庆
2 材料与试剂 柑橘样品均采自中国农业科学研究院柑桔研究所国 家果树种质重庆柑橘圃。 圣草枸橼苷(纯度97.4%)、柚皮素-7-β-芸香糖苷(纯度 95.0%)、新橙皮苷(纯度99.9%)、香风草甙(纯度93.1%)、 柚皮素 ( 纯度 98.2%)、橘黄酮 ( 纯度97.1%)、橙皮素 ( 纯度 94.6%)(标准品) 品 ( 纯度 98.5%) 度96.4%) 美国Chroma Dex公司；甜橙黄酮标准 德国 Phytolba 公司；川皮苷标准品 ( 纯 瑞士Fluka公司；甲醇(色谱纯) 2.1
德国CNW Technologies有限公司。 Acquity UPLC 色谱仪 ( 配有 PDA 检测器及 Empour 工 美国 Waters 公司； 3K15 高速冷冻离心机 美 国 Sigma公司；KQ5200DE 超声波清洗器 超声仪器有限公司；超纯水器 0.22μm有机相针式滤器 1.3 1.3.1 方法 标准品溶液的制备 准确称取圣草枸橼苷、柚皮素 -7- β - 芸香糖苷、柚皮 苷、橙皮苷、新橙皮苷、香风草甙、柚皮素、橙皮素、 甜橙黄酮、川皮苷和橘黄酮各5.00mg，分别用色谱纯甲 醇溶解并定容至10.00mL容量瓶中，配成500mg/L标准品 的母液备用。 采用逐级稀释法用色谱纯甲醇溶液将标准品溶液配 制成一系列质量浓度的混合标准品溶液。 1.3.2 样品的制备 柑橘果皮样品：鲜果皮磨细后备用。准确称取制好 样品 1.00g 于 50mL 离心管中，加入甲醇溶液 10.00mL ， 50℃条件下超声处理30min，以10000r/min离心10min， 收集上清液，残渣均以10mL提取剂重复提取两次，合并 上清液定容至50mL，0.22μm微孔滤膜过滤后待测。 江苏昆山市
表1 Table 1 流动相体积配比/% 0.2%乙酸溶液 甲醇 流动相洗脱程序 Gradient elution program 0 90 10 5 70 30 洗脱时间/min 10 15 20 80 20 80 16 90 10
美国Sigma公司；橙皮苷(纯度93.7%)、柚皮
苷(纯度97.3%)(标准品) 1.2 作站 ) 仪器与设备
※分析检测
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chromatography，UPLC)，基于小颗粒填料、低系统体积及 快速检测等技术，具有快速高效、高分离度等特点 Spácil等
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柑橘汁样品：采用手动压榨法制取新鲜柑橘果汁，用 双层纱布过滤后备用。准确吸取制好果汁样品2.00mL置于 50mL离心管中，加入10.00mL甲醇振荡1min，以10000r/min 离心10min，分离上清液，残渣以10mL提取剂重复提取一 次，合并上清液定容至25mL，过0.22μm微孔滤膜后待测。 1.3.3 色谱条件 色 谱 柱 ： A C Q U I T Y U P L C B E H C 18分 析 柱 (2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：甲醇和0.2%乙酸溶 液，采用梯度洗脱；柱温：35℃；流速：0.3mL/min；定 量波长为283nm和 330nm，波长扫描范围200～ 400nm， 进样量为3.0μL。以保留时间结合光谱扫描图定性，采用 外标法定量。
结果与分析 检测波长的选择
对11种类黄酮(8种黄烷酮和3种多甲氧基黄酮)标准物 质进行扫描，属黄烷酮类的圣草枸椽苷、柚皮素-7-β-芸 香糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香风草甙、柚皮 素和橙皮素均在 283nm 附近有最大吸收峰，而属于多甲 氧基黄酮的橙黄酮在 330nm 附近有最大吸收峰，川皮苷 和橘黄酮在270nm和330nm附近都有最大吸收峰，综合考 虑最终选取283nm和330nm分别作为黄烷酮和多甲氧基黄 酮的定量检测波长。 2.2 柱温和流动相的选择
美国 Millpore 公司；
上海安谱科学仪器有限公司。 随着柱温升高，色谱柱的柱效增加，分析时间缩 短，但对目标物的分离度有一定影响。综合考虑确定 35℃作为色谱柱分析时的温度。 实验比较不同流动相溶液的分离效果，结果显示采 用乙腈-乙酸溶液作为流动相时，在橙黄酮、川皮苷和橘 黄酮出峰处存在较强基线干扰，而使用甲醇-乙酸溶液作 为流动相时可消除基线干扰，因此选择甲醇-乙酸溶液作 为色谱分析的流动相体系。对于 11 种类黄酮物质来说， 其结构和性质相似，需采用梯度洗脱的方式进行分离， 经优化确定梯度洗脱条件如表1所示。在该条件下，11种 类黄酮标样和柑橘样品色谱图见图1，根据相对保留时间 并结合待测化合物的特征吸收波谱进行定性。由图1可以 看出，样品中类黄酮化合物与其他杂质分离，各个物质 的峰形良好，分离度高。因此本方法适合柑橘中类黄酮 化合物的测定。
、抗癌作用、抗动脉粥样硬化、抗氧化功能
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和抗菌 等多种生理作用，国内外已有不少相关文献报道 将其用于功能食品和功能饲料的生产研究中。此外，类 黄酮种类和含量的差异可作为鉴别柑橘产品掺假 、品种
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收稿日期：2012-03-30 基金项目：国家现代农业(柑橘)产业技术体系建设专项(CARS-27)；国家“948”计划项目(2012-Z13) 作者简介：冉玥(1988—)，女，硕士研究生，研究方向为食品安全与质量控制。E-mail：ranyue1988@126.com *通信作者：焦必宁(1964—)，男，研究员，本科，研究方向为果蔬贮藏加工技术与质量安全。E-mail：bljiao@tom.com
Simultaneous Determination of 11 Flavonoids in Citrus Fruits by Ultra Performance Liquid Chromatography
RAN Yue1,2，JIAO Bi-ning1,2,*，ZHAO Qi-yang2，TIAN Ling2，SU Xue-su3，ZENG Chao-bo3 (1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Laboratory of Risk Assessment for Citrus Quality and Safety, Ministry of Agriculture, Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China； 3. College of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400716, China) Abstract：A rapid method for qualitative and quantitative analysis of 11 flavonoids in citrus was developed using ultra performance liquid chromatography (UPLC) coupled with photodiode array detector. Under the condition of methanol-. acetic acid water solution as mobile phase and gradient elution, 8 flavanones and 3 polymethacrylate flavones were separated within 11 min. The detection wavelengths were 283 nm and 330 nm. The limits of detection were from 0.005 to 0.02 mg/kg (RSN = 3) and good linearity was observed with the correlation coefficient above 0.9993.The influencing factors for sample preparation were optimized by using orthogonal experiment design and the recoveries of compounds analyzed from peel and juice samples were over the range of 94.6%–100.2% with RSD between 1.1% and 3.7%, and within the range of 94.5%–101.8% with RSD between 0.9% and 3.9%, respectively. Compared with the previously reported methods, this method was more effective, environmentally friendly and reproducible. Key words：ultra performance liquid chromatography (UPLC)；citrus；flavonoid；orthogonal experiment 中图分类号：S666 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)04-0168-05