组织细胞学观察研究方法课件

生物显微技术讲义

唐山师范学院生命科学系

陈超石洪凌

2005.3

生物显微技术是高等院校生物系各专业的基础课,包含生物材料固定技术、生物染色技术、各种显微切片制作技术、显微化学技术显微摄影技术。通过这门课的学习，希望能够帮助大家加强生物实验的技能。使学生掌握制作动、植物显微切片的技术,掌握使用光学显微镜及进行显微摄影所必备的基本理论、基本知识和基本技术。

本《生物显微技术大实验》是为了配合这门课的教学，在参考了国内一些相关教材的基础上，结合本教研室的历年实验经验与心得而编写的，仅供唐山师范学院生命科学系学生使用。生物显微技术的内容在其他教材中叙述比较零乱，没有统一的整体性。本指导在结合我系教学安排和实验的前提下，有针对性的安排了生物显微技术的理论教授和实验指导。内容主要包括石蜡切片的制作、显微摄影知识、数码显微镜及软件的使用。

由于编者业务水平和工作经验所限，虽然做了大量努力，书中难免还会存在缺点和不足。为此切盼广大师生在使用本书过程中能提出批评和建议，以备在以后的日子里改进和提高。

编者

2005年1月于唐山师范学院

第一章生物制片 (4)

第一节前期准备 (4)

第二节生物制片分类 (8)

第三节石蜡切片 (10)

第二章显微摄影技术 (37)

第三章暗室技术 (48)

第一节感光材料 (48)

附彩色显微摄影和黑白显微摄影的相关知识 (53)

第二节暗房工艺 (57)

第四章数码显微摄影 (64)

实验一徒手切片与整体制片法.......... .. (66)

实验二1、石蜡切片技术—固定、染色、返蓝 (70)

2、石蜡切片技术—脱水、透明、浸蜡、包埋 (72)

3、石蜡切片技术—切片、粘片、脱蜡、透明、封藏74

实验三显微摄影及暗室技术 (78)

实验四数码显微摄影及研究分析软件的使用 (88)

实验五所作切片的观察照相、提交作业 (99)

第一章生物制片

第一节前期准备

一、玻璃器皿的清洗：

（一）生物学实验使用的玻璃器皿及玻片均要清洗干净, 应以壁面被水均匀润湿而无水珠为标准。

表1-1一般器皿的洗涤方法

玻璃器皿经洗涤液清洗后→自来水冲洗→蒸馏水冲洗→倒放于大张滤纸上晾干或玻璃仪器烘干器烘干。

（二）洗液配法：重铬酸钾 20g

浓硫酸 100ml

清水 100ml

先将重铬酸钾溶于水中，在一滴滴加入浓硫酸，边加边搅拌，颜色为红褐色放于玻璃容器内可反复使用，一直到颜色变为蓝黑色为止。

（三）新旧载玻片及盖玻片的清洗：

1．新的：2%盐酸酒精（95%酒精100份加浓盐酸2份）浸泡几个小时→流水冲洗干净→95%酒精中待用。

2.旧的：没用树胶封片的：洗衣粉煮沸5-10分钟→清水冲洗→洗液30分钟→流水冲洗→蒸馏水洗净→95%酒精中待用。

3.树胶封片的玻片：二甲苯浸泡、洗净→95%酒精中待用。

二、溶液的配制：

（一）百分比浓度 :质量百分比浓度。即100g溶液中所含溶质的克数。

1.稀溶液的配臵：

例1：1%的番红水溶液—即将番红1克溶解于100 ml的蒸馏水中。

例2：0.1%固绿酒精溶液—即将固绿0.1克溶解于100ml的95%酒精中。

2.浓溶液的配臵：配臵高浓度的溶液，应在100ml的水中减去溶质重量的水。

例：15%NaCL称取15gNaCL,溶于85ml水中。

（二）摩尔浓度：1升溶液中所含溶质的mol数。用M表示。

例：配制500ml 2M NaCO

3

溶液

称取2×106×0.5=106g NaCO

3

溶于500ml水中。

（三）当量浓度：1升溶液中所含溶质的克当量数。用N表示。

当量（E）与分子量（MW）的关系：E=MW/n

其中酸的n为酸分子中可被金属取代的氢原子数

碱的n为碱分子中金属的原子价

盐类的n为盐分子中金属的原子数乘金属的原子价

如：HNO

3

的当量=63/1=63

H 2SO

4

的当量=98/2=49

Ca(OH)

2

的当量=74/2=37

Al

2(SO

4

)

3

的当量=342/2*3=57

一般溶液的配制用烧杯、量筒；准确溶液的配制用容量瓶。

(四)酒精稀释法（交叉稀释法）：

95%酒精→83%酒精

先在量筒中加入83ml95%酒精,再加水至95ml即得。

95%酒精→70%酒精

先在量筒中加入70ml95%酒精,再加水至95ml即得。

95%酒精→50%酒精

先在量筒中加入50ml95%酒精,再加水至95ml即得。

95%酒精→35%酒精

先在量筒中加入35ml95%酒精,再加水至95ml即得。（五）常用液态酸的配臵：

表1-2常用液态酸的配制

三、制定实验计划：

制定计划时首先要考虑到制片的目的，其次是选择制片的标本，最后才是确定具体的制作方法。例如制玉米茎的横切面，其目的在于观察维管束的结构，那么就应选择老的茎作标本。又如作某一种叶子的生态解剖，所选择的标本就不应该再同一地点，应在不同环境条件下多采集几份，才好做比较。由此可见制片的目的与标本选择有密切联系，有时甚至二者是需要同时决定的。

最后可根据目的要求及所选择的标本确定具体制片的方法。一般讲，制片技术的方法虽然很多，但对某一材料来说可能多不是十全十美的。因此我们在制定计划时，不妨多采用几种方法，以便比较。同时也要注意经济原则。方法确定后，在计划中还需将所用的药品、用具等名称及数量逐一列出，然后在定出具体的工作日程。

制订试验计划需要比较丰富的知识和经验，所以在订计划之前，必须要阅读参考文献，深入钻研。初学者可在有经验的老师指导下制订出比较完善和精密的实验计划。（四）日程与记录：

制片是一个连续的过程，从标本的采集、固定、切片、染色到封藏为止，往往要连续几天，如果事前没有工作日程、就会造成混乱。除编排日程表外，还必须将工作过程中的实际情况连同日程表都详细的记载在记录本上。这样可根据结果检查实际工作中的问题所在，总结失败原因，也可以总结成功的经验。所以日程表和详实地记录对制片工作来说，是一件非常重要而且必须长期坚持的工作。这些记录不仅要详实，而且还要作为档案保存起来。