第七章工业微生物原生质体育种和原生质体融合

（二）原生质体融合
1、融合亲本选育 • 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株
原生质体融合是一随机过程，原生质体间无亲和 选择性，当两种原生质体A和B混合到一起时，发 生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合 是有效的融合，概率为33.33%，当然还有多个原 生质体融合到一起的可能。
间接法 把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上， 使亲株和重组子都再生成菌落 ，然后用影印 法将它们复制到选择培养基上检出重组子。
融合重组的频率 =
融合重组子
两亲株原生质体再生菌落的总数
远缘亲本原生质体融合
3)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是 二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为 一的过程。
4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融 合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合 亲株。
6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
20世纪80年代，真正意义上的细胞工程诞生了， 细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。
三、原生质体融合育种的特点
1)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件 下形成类似于球形的原生质体。
2)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中 任何一株都可能起受体或供体的作用，因此 有利于不同种属间微生物的杂交。
例子：利用抗性标记进行的融合细胞筛选
2）原生质体灭活：诱变形成的遗传标记往往 也会使一些优良性状被丧失，对以选育生 产性状为目标的育种不能实现，可采用灭 活原生质体法作为检出标记，如采用碘代 乙酰胺灭活处理真菌原生质体，使处理后 的原生质体失去再生能力，而对真菌遗传 特性无损伤，当两种采取不同灭活剂处理 的原生质体融合后，可以完成代谢互补， 是融合子回复再生能力。
间形成细胞质通道（37℃下
1-2min），通道继续扩大， 病毒颗粒流入细胞质内，细 胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。
特点
研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法
包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为
H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后
三、原生质体转化育种 菌种活化和与培养→ 原生质体制备→离心洗 涤，取原生质体悬浮液1ml，2倍SMM浓缩液和 质粒DNA各0.1ml，然后加入40%聚乙二醇 4000ml，混匀后静置2min,离心，悬浮于 1mlHCP培养几种，适当稀释后分离在选择培 养基上，双层平板培养，筛选转化子。
第二节 微生物原生质体融合育种
• 为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般 都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型 或抗药性等
2、原生质体融合的方法
物理法、化学法及生物法 。 原理
增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法
在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子， 彼此靠近，定向排列成串球状。
A-B，A-A，B-B。 A-A-A，B-B-B等多聚体。 未融合的A，B。
2、杂种细胞筛选方法
（1） 选择性培养基筛选法：利用原生质 体对培养基成分要求与反应的差异选择 杂种细胞的方法。
例如：利用抗性标记、酶缺陷型、激素 需求差异等。亲本原生质体生长要求外 源激素，而有的杂种细胞由于双亲互补 作用会产生内激素，从而使杂种细胞能 在无激素的培养基上生长
5)破壁时的pH值:对离子强度影响较大
6)渗透压稳定剂
等渗透压在原生质体制备中起到保护原生 质体免于膨裂，有助于酶和底物的结合， 渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗 糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。
5、原生质体制备程序
• 菌体培养：液体培养 固体培养 • 收集菌体：过滤收集、离心收集无菌水冲洗 • 洗涤菌体：等渗液冲洗等渗液与酶液相同 • 酶解处理：保温酶解 稀释终止酶解，离心去酶 • 过滤分离：过滤去掉为分界菌丝体 • 查速离心：收集大小密度均一的原生质体，低速
2、微生物细胞壁组成
• 微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成不同， 酶解处理的有效酶也不一样，因此要求根据微生 物种类特性选择合适的酶。
• G+:糖肽、低聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛 酸磷壁酸
• G-：糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂 蛋白、二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳 糖
真核细胞壁组成
发生的合并现象。
1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ) 能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。
20世纪七十年代初，华裔加籍科学家高国楠发现 聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了 植物细胞融合的研究。
细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞 伴随者细胞融合技术的成熟。
1）用硫酸镁、甘露醇、山梨糖、蔗糖为渗透剂，不 同的微生物种类应选择不同的再生培养基；
2）营养因子：酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖类； 3）原生质体保护剂扩张剂的作用
牛血清白蛋白、人血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷 酮、明胶等对原生质体具有保护作用，同时起到 原生质体扩张剂作用，次级原生质体再生作用；
4）加入再生细胞壁诱导物及前体物质 在培养基中加入明胶、细胞壁残片甚至
特点
融合率高、重复性与可控制性强。 装置精巧、方便简单。 可在显微镜下观察或录像融合过程。 可能会造成不可恢复的细胞损伤。
(2)生物法
各种病毒都具有凝集细胞的能力，它一边粘接在一 个细胞表面，另外一边粘接在另一个细胞表面，从 而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。
仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA 与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活 而常采用。
离心其沉淀物，高速离心弃上清液，的纯化原生 质体。
原生质体的保存
较低的温度可以有效保持原生质体的活性； 细菌：48小时 放线菌：24小时 真菌0-4℃保存2天
影响原生质体存活的遗传因素
• 细菌易再生可达90%以上，有些种类也很低； • 小单孢菌只有10%； • 放线菌可达50%； • 丝状真菌“产黄青霉”40-60%。
一、定义与意义 细胞融合（Cell fusion）也叫细胞杂交是指使
用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一 个细胞的技术。
由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间 细胞的融合，因此细胞融合技术在创造新细胞、 培育新品种方面意义重大，也被广泛应用于细胞 生物学和医学研究的相关领域。
基因Fra Baidu bibliotek相同的细胞融合成的融合细胞称为同核 体，来自不同基因型的融合细胞则称为异核体。
种类 疫霉属 毛霉属 酵母属 镰刀霉属 裂褶菌数 鬼伞属
纤维素 25 0 0 0 0 0
几丁质 0 9 1 39 5 33
其他多糖 65 44 60 29 81 50
3、制备原生质体的酶类
自然界中多种生物都能合成破坏降解菌体细胞壁的酶，如蛋 清中的溶菌酶，蜗牛消化酶，寄生性微生物合成酶。 包括： • 纤维素酶 • 酵母裂解酶 • 几丁质酶 • 商品酶：
从融合效果上，细胞融合包括： ✓ 对称融合：即两个完整的细胞间的融合。 ✓ 不对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的
核或细胞质失活后再与另外一个完整的细胞进 行融合。
二 、发展历史
细胞融合现象最初是在动物细胞中表现的。 1858年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组
织中的多核细胞情况。 1875年观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞
3)酶浓度
对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类 要求不同，对酶的浓度也有差异。最佳酶 浓度还随不同的生长期的菌体而变化。
• 酶浓度合适，浓度太高对原生质体有破坏 作用，影响原生质体的再生
4)酶处理温度 :根据具体情况,细菌高,酵母 及霉菌稍低。过高的温度使酶失活，原生 质体失活；过低的温度酶活性不高，影响 原生质体细胞膜稳定性
进一步提高了PEG法的效率。
(4)方法选择
具体应用时要根据不同对象选择不同的细 胞融合方法和条件。
诱导动物细胞融合，仙台病毒HVJ诱导、 PEG法、电融合法都适用；植物细胞融合常 用PEG法和电融合法；微生物细胞融合多采 用PEG法 。
（三）融合体的再生
1、再生培养基：应具备维系、保护、支持和营养的 功能
第七章 工业微生物原生质体育 种和原生质体融合育种
第一节 原生质体育种
一、原生质体再生育种 出发菌株的选择→菌种活化和与培养→原生 质体制备→原生质体再生→高产菌株分离→ 复筛→遗传性状鉴定→菌种特性和发酵特性 研究
二、原生质体诱变育种 菌种活化和与培养→原生质体制备→原生质 体悬浮液稀释至一定浓度，取一定放入无菌 平皿中→ 紫外灯下诱变处理→ 置暗处后处 理→ 再生培养→高产菌株分离→复筛→遗传 性状鉴定→菌种特性和发酵特性研究
3）荧光染色：在获得原生质体后，分别用不 同的英冠素染色亲本原生质体，随后融合， 融合子于紫外光显微镜下挑取融合子（融 合子发出两种亲本的颜色）。
4）再生后杂种与亲本形态、性质差异
重组子的检出方法有两种：
直接法
将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的 高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子
仙台病毒有若干附着点，可以同时吸附在两个细胞 表面。由于病毒体积很小，由一个病毒吸附的两个 细胞靠得极近，使细胞膜融合在一起，成为一个杂 种细胞。
原理与过程
灭活后的病毒颗粒结合到原 生质体表面。两受体细胞开 始凝聚。
两细胞的膜紧密结合。病毒 被膜与受体细胞的浆膜融合 。病毒颗粒周围的膜脱离整 个膜，产生破口，在两细胞
席位苏滤膜都有刺激原生质体再生的功能。 2、再生培养温度
过高温度对原生质体再生有一只作用， 当再生温度略低于菌株培养温度时，有利 于原生质体的再生 3、操作方式涂布培养法对原生质体有损坏
4、固体培养
一般认为固体培养优于液体培养。液体培 养时细胞壁可溶性物质很容易扩散（如酵 母在液体再生液中很难再生）；
✓ Novozyme234来自Trichoderma harzianum
✓ Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 ✓ Gglucuronidase葡聚糖甘酸酶
4、影响原生质体制备的因素
1)菌体的前处理 为了将菌作一些前处理使酶作用的效果好一 些， 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。
2)菌体的培养时间 选择增殖期的菌体，使细胞易于原生质体化。
引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发 生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻 底融合。
高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导
高Ca2+机制：带负电荷间的原生质体在钙离 子的连接下形成静电键——钙桥，促使异 源的原生质体间粘着和结合。
高pH：增加Ca2+在细胞表面的黏附，从而促 进两原生质体的接触。
固体培养基限制有效分子的扩散，但先在 液体培养基中预培养2-3小时有利于提高再 生率。
（四） 融合细胞筛选
1、筛选的原因与必要性
细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞 将以多种形式出现，需要通过培养和筛选，除去 不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解 决融合细胞的选择问题。
问题：A与B融合过程中，你能预见有哪些形式的 细胞吗？
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。
膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
具体步骤
DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，它们 与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链 紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射 峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm ，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。染色标记细 胞核的位置。
融合过程中细胞膜变化
类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合
五、原生质体融合技术
• 原生质体制备 • 原生质体纯化 • 原生质体融合 • 融合子检出 • 融合子鉴定
（一）微生物原生质体制备
1、定义及特点 定义：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生 质体。 特点：无细胞壁，可以方便地进行遗传操 作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操 作。 具有全能性，能再生细胞壁。