脐血单个核细胞分离方法的比较及形态学改变

脐血单个核细胞分离方法的比较及形态学改变

作者：李敏,张季红,徐佩茹作者单位：新疆医科大学第一附属医院，新疆乌鲁木齐830011

【摘要】目的:探索一种简便、高效的脐血单个核细胞分离方法。方法:以Ficoll密度梯度离心法与羟乙基淀粉(HES)分离法进行对比,比较两种分离方法分离脐血所得的单个核细胞(MNC)细胞数，并观察两组单个核细胞不同培养时间下形态学变化。结果:两种分离方法在分离脐血MNC方面存在着显著性差异,其中以HES法效果较好,但HES法所得细胞培养后生长状态欠佳。结论：HES法是一种高效的脐血单个核细胞分离方法,但该法所得细胞的生长状态欠佳，需进一步实验证实。

【关键词】脐血/胎血;单个核细胞;分离

Comparison the differences of two isolation methods of mononuclear cells derived from human cord blood and observation of morphology changes

LI Min，ZHANG Ji-hong,XU Pei-ru

(Department of Pediatrics,First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical

University,Urumqi830011,China)

Abstract:Objective:To explore an convenient and high-performance isolation method of mononuclear cells derived from human cord blood.Methods:The isolation methods including the hespan isolation and Ficoll isolation were analyzed by mononuclear cells amount.The morphology changes of cells in different isolation methods were observed. Results:The hespan isolation was better than Ficoll isolation in isolation of mononuclear cells derived from human cord blood.But mononuclear cells growth condition was below the mark from the hespan isolation.Conclusion:The hespan isolation was a

high-performance isolation method of mononuclear cells derived from human cord blood. But mononuclear cells growth condition was below the mark and need further confirm by experiment.

Key words:Human cord blood;mononuclear cell;isolation

近年来,脐血（umbilical cord blood,UCB）已成为除骨髓以外的重要间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源,具有来源更为充足、免疫原性更弱、供者无痛苦、不涉及伦理问题、传播疾病的几率低、含有的干细胞丰富等优点。大量的实验证实,脐血中的MSCs可在体外培养,诱导分化后能成为神经细胞(神经元和神经胶质细胞)、心肌细胞［1～3］等，故而UCB-MSCs有广阔的应用前景。但现有的细胞分离方法以及扩增、分化技术还远远难以满足生物学领域对UCB-MSCs的需求,因此寻找更加简便、高效的UCB-MSCs

分离、培养方法是十分必要的。UCB-MSCs是从脐血分离的单个核细胞培养生成，我们拟对此作一些有益的研究，比较脐血的单个核细胞分离方法及培养前后的细胞形态学改变。

1材料与方法

1.1标本来源选择新疆医科大学第一附属医院产科足月或早产妊娠健康产妇的脐血用于实验,产妇年龄24～35岁,无肝炎、梅毒、结核及其他妊娠并发症。实验于2007年5～10月在新疆医科大学第一附属医院细胞室完成。用于实验的脐血20份随机分为2组处理:淋巴细胞分层液法处理组、羟乙基淀粉沉淀法处理组。

1.2主要试剂低糖DMEM(GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青)、淋巴细胞分离液(上海华精)、羟乙基淀粉（贺斯，北京费森尤斯卡比）、传统型血袋（生复）。

1.3方法

1.3.1取血按照脐带血标本采集标准，足月或早产分娩,排除传染性疾病及各种家族遗传疾病,标本采集严格无菌操作。使用复方枸橼酸血液保护液抗凝。

1.3.2单个核细胞的分离及计数脐血平均容积为50～100ml，标本在采集后的3h 内进行分离。随机将脐带血分为两组处理：一组为淋巴细胞分离液法，将血袋内的抗凝脐血导入250mL无菌瓶中,与Hanks液1∶1稀释。取数个无菌离心管,先加入比重为1.077 g/cm3的淋巴细胞分离液5～15ml,无菌吸管吸取稀释后的脐血10～30ml,缓慢加入形成一明显的界面，2000r/min离心20min，小心吸取中间白膜层,磷酸盐缓冲液洗涤2次,彻底弃上清。椎虫蓝进行活细胞计数,计算获取的单个核细胞的数量。一组为羟乙基淀粉沉淀法，将脐血与6%的羟乙基淀粉按照4∶1的比例混匀,4℃下静置1h,取上清,1500r/min 离心10min,磷酸盐缓冲液洗涤1次,椎虫蓝进行活细胞计数,计算获取的单个核细胞的数量。同时记录实验进行时间。

1.3.3单个核细胞的培养观察将单个核细胞用含体积分数0.2的胎牛血清的低糖DMEM培养基,调整细胞密度接种于25cm2培养瓶中,在体积分数0.05的CO2,37℃细胞培养箱中进行培养,3d后全量换液,以后每隔3～4d半量换液。用倒置显微镜观察生长状态。主要观察指标:(1)两种分离方法处理的人脐带血所获得的单个核细胞数。(2)两组单个核细胞不同培养时间下生长状态的比较。

1.4统计学处理采用随机对照实验，计数资料实验结果以±s表示,采用两独立样本均数比较的t检验，计量资料采用两独立样本率比较的χ2检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1两种分离方法处理的人脐带血所获得的单个核细胞数淋巴细胞分层液获得的单个核细胞数量为(

3.91±0.63)×106/ml,羟乙基淀粉沉淀法获得的单个核细胞数量为

(12.78±1.69)×106/ml,二者比较差异有统计学意义，见表1。

2.2各组单个核细胞在不同培养时间生长状态的比较两组细胞开始时均为小圆形细胞，随后为卵圆形、圆形及梭形细胞的混合体,以后可见贴壁生长的梭形细胞增多,与此同