神经元培养步骤

新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定

11 21 1 培养器皿的预处理: 包被D -多聚赖氨酸: 将无菌处理的血盖片放入

24孔聚乙烯培养板( Falcon) 或直径为35mm 的塑料培养皿( Falcon) 内, 在培

养前24 小时用终浓度为50Lg/ ml 的多聚赖氨酸50Ll/ cm2 包被血盖片及培养

皿各孔, 37e 5% CO2 孵箱孵育过夜。临用前吸弃D- 多聚赖氨酸液, HBSS

液清洗2 次即可使用。

1.大鼠大脑皮质神经元的分离及培养

2大鼠大脑皮质神经元的形态学观察

光学显微镜: 细胞接种后, 每天在倒置相差显微

镜下观察神经细胞的生长情况, 拍照记录。

台盼蓝染色计数活细胞取0.1 mL 的体积分数为0.4% 台盼蓝加到0.9mL 细胞悬液中, 充分混匀后立即滴加到血球计数板上并分别计数未染色的细胞数(活细胞) 及染色的细胞数(死细胞)。用台盼蓝染细胞时, 活细胞拒染, 死细胞可摄取染料。计算公式: 每mL原液的细胞数= 4个大方格的细胞总数/4 X 104X稀释倍数。

3-1神经元的免疫细胞化学鉴定

Dapi + NF

3-2大脑皮质神经元纯度的鉴定( Nissl. s 染色)

将细胞爬片的小玻片用0. 01 mo l/ L 的PBS 漂洗, 40 g/ L 多聚甲醛固定, 再用10 g/ L 甲苯胺蓝染色, 梯度酒精( 70%、80% 、95% 、100%) 分色, 置倒置相差显微镜下, 随机观察并计数30 个视野( 目镜10 @ , 物镜20 @ , 框面积0. 3 mm2) 内的神经细胞数。连续观察10 d, 并拍照记录。

神经元比例( % ) = NF阳性细胞数/DAPI(+) 星形胶质细胞比例( % ) = GFAP阳性细胞数/DAPI(+)

鉴定②NF 荧光免疫细胞化学染色 : 神经丝( neurofilaments, NF) 蛋白是构成神经轴突和树突的主要结构成分 , 在中枢和外周神经系统的神经元细胞核周、特别是轴突有表达, 也是神经元特异性标志物之一。固定后的细胞用PBS 洗 2 遍 , 每次 5min,0.4%triton X- 100作用 20min, PBS洗 3 遍, 山羊封闭血清封闭 30min, 加 NF 单抗( 1:50) 4℃孵育过夜 , PBS 洗 3 遍 , 加 FITC 标记的

羊抗鼠二抗室温孵育 3h( 避光) , PBS 洗 3 遍 , 加 PI 作用 10min, PBS 洗后加 50%的甘油 PBS 封片 , 激光共聚焦显微镜下观察并照相 , 其中胞浆和核均着色者为阳性神经元 , 仅胞核着色者为阴性细胞。

4皮质神经元活性的测定( MTT 法)

1. 3. 3 海马神经元细胞活力测定3种培养液不同时间段(1、3、7和10 d)海马神经元活力状况:

1. 3. 3. 1 台盼蓝排斥实验

[5] 取出3组培养液培养不同时间段的神经元各10孔,用等量的0.15%台盼蓝浸染5m in,分别在倒置相差显微镜( X400)下随机观察并计数10个视野中神经细胞数(细胞总数不少于500个),根据不排斥染料的细胞数, 计算细胞的活力百分数。细胞的活力(% ) =细胞总数-蓝染细胞(死细胞) /细胞总数。

1. 3. 3. 2 MTT测定

[6] 分别取3组培养液培养不同时间段的神经元进行MTT检测, 加入终浓度为

0.1 5 g/L的MTT, 4 h后弃去培养液, 再加入细胞溶解液(含40% N, N-二甲基甲酰胺, 10% SDS, pH41 0)溶解,用酶标仪测定各孔吸光度( K= 550 nm,OD值), OD值与细胞活性成正相关。

分别以1 X106、1 x 105 / m L 细胞悬液接种于96孔细胞培养板中, 每个接种密度设20 个重复孔, 同时设不加细胞的空白对照孔。每2~ 3 d 半量换液1 次。

从培养第1 d 起, 加M T T( 5 m g/ m L) 到试验孔和空白孔中; 然后用铝箔纸包起培养板, 在37 e 50m L/ L CO2 温箱中孵育4 h, 加DM SO 溶解M TT-甲结晶。读取D570 nm 值, 以空白孔读取空白对照值;连续测定10 d, 绘制出吸光度和培养天数关系折线图, 确定神经元活性最强的时间。

将密度为 2 x 105/ cm2的单细胞悬液种植于铺过多聚-L-赖氨酸的96孔培养板, 每孔200 LL, 设5个复孔。每天取6孔, 每孔加入5 m g /mL 的MTT 液20 LL, 37 e 、体积分数为5% CO2 的饱和湿度下培养 4 h后取出, 去除上清, 每孔加150 LL DMSO , 振荡至蓝色颗粒全部溶解, 用酶标仪在490 nm 处、干涉波长655 nm 测出A 值。根据A 值以各时间点吸光度的平均值为纵坐标, 时间(天数) 为横坐标, 绘制生长曲线。

摘要: 目的研究体外原代培养新生大鼠海马神经元的方法, 并观察其发育分化过程中形态学的变化。方法生24 h内的W istar大鼠分离海马, 消化后差速贴壁, 种植在涂有多聚-L-赖氨酸的盖玻片上, 于不同时间在倒置显微镜下观察形态变化; 采用NSE免疫细胞化学技术鉴定神经元。结果神经元12~ 24 h后大部分贴壁, 随时

制成细悬液。转至塑料培养瓶中, 加入10% FBS 置CO2 培养箱( 37 e 、5%CO2、95% 湿度) 内。差速贴壁1h后, 收获贴壁速度慢的神经元, 用台盼蓝染色法进行活细胞计数, 以1 @ 105的密度将细胞种植于6孔培养板中, CO2 培养箱中培养24 h后全量换液, 以后每周2~ 3次半量换液。每天在倒置相差显微镜下观察神经元的生长情况。

关键失败

在细胞的分离过程中, 严格掌握脑组织消化分离时间、细胞接种数量是较重要的。我们采用低浓度胰蛋白酶, 短时间( 0.125% , 15min) 消化的方法,尽可能减少分离过程中的化学损伤, 这样更好保持了细胞的活力。细胞接种密度亦是影响培养效果的。

细胞接种密度也是影响培养效果的重要因素,一般接种密度应维持在 1 @ 105~ 1 @ 106

, 否则会因为密度太低使神经元缺乏相互间的支持和营养作用而死亡, 而密度过高神经元之间突起互相交错不便于观察单个神经元体外发育过程中的变化。

差速贴壁是一种损伤小的纯化方法, 成纤维细胞、胶质细胞与神经元相比贴壁过程快; 而神经元在短时间内不附着或附着不稳定, 轻微震荡就可以浮起。本结果表明差速贴壁法可以达到较高的纯度, 同时又避免了对神经元的人为损伤。

无菌环境

[ 3]曾用无血清的DMEM /F12作为海马神经元体外培养的培养液, 本研究发现培养24 h 后,神经元几乎没有突起生成, 48 h后细胞全部死亡,加入一定量的胎牛血清后神经元生长良好,但胎牛血清具有不稳定性, 且实验过程中需要添加阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的生长,阿糖胞苷的加入和去除, 反复更换培养液,变更细胞的生长环境会对神经元的生长造成不良影响。此外, 阿糖胞苷对神经元的生长也有一定的毒副作用。