荧光物质稀溶液的激发、发射和同步荧光光谱测定

荧光物质稀溶液的激发、发射和同步荧光光谱测定

实验目的：

学习荧光分析法的基本原理，掌握LS-55B发光分析仪的操作；学习同步荧光发的操作和原理；利用仪器测定苯酚溶液、固体等不同条件和设置下的光谱图，尝试测定3D光谱图。

实验原理：

荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。

在一定光源强度下，若保持激发波长不变，扫描得到的荧光强度与发射波长的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持不变，扫描得到的荧光强度与的关系曲线，则称为荧光激发光谱。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。

苯酚由于其共轭结构，有荧光活性，可以用荧光分析法测定。它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。对于复杂组分，当激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象时，可以用同步荧光扫描，同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。

实验仪器和试剂

LS-55型发光谱仪;苯酚储备液、去离子水;固体样品（纸）

右图为萘的荧光（激发发射和磷光图谱）

四. 实验内容

1.预扫描(pre-scan)

用储备液配制浓度为10ppm（mol/L）的工作液，设定仪器参数，进行全波长预扫描，并记录扫描结果，得出最大激发和发射波长，同时查看其瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。2．激发光谱、发射光谱和同步荧光扫描

①设定合适的参数，分别对苯酚溶液进行荧光激发、发射和同步荧光光谱扫描。

②取浓度为0.010（mol/L）的工作液，扫描发射光谱，加水稀释后再在同样波长下扫描发射光谱，观察荧光猝灭效应。

发射光谱参数：扫描波长范围200—750nm；Ex=214nm、270nm，扫描速度=1000 nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=5nm,，记住取文件名。

激发光谱参数：扫描波长范围200-750nm，=300nm、586nm，扫描速度=1000nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=5nm,记录信息。

同步荧光光谱：扫描波长范围250-750nm, Δλ(-)=30nm、86nm,扫描速度=1000nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=5nm,记录信息。

3．三维荧光光谱扫描设定发射波长范围，激发开始波长，步长，测定数目，开始进行苯酚三维荧光光谱扫描。

五．数据处理

参数设定：

取浓度为0.01（mol/L）的苯酚溶液，固定激发光的波长为270nm，狭缝宽度为10.0nm，发射光的狭缝宽度为5.0nm，扫描波长范围250—750nm，扫速为1000nm/min，扫描荧光强度与发射光波长的关系曲线，所得全部光谱曲线如下：

预扫描图：

EXCEL制作的荧光光谱图：

1．用实验获得的数据绘制苯酚的激发、发射、同步光谱。

电脑拷贝的激发、发射荧光光谱：

同步荧光光谱图：

（电脑拷贝）

电脑拷贝同步荧光光谱图：（稀释后）

2．对比不同浓度下的苯酚的最大激发波长和最大发射波长处的峰高，了解荧光猝灭效应。

苯酚标准荧光图谱：

EXCEL制作的稀释后苯酚荧光光谱图：

电脑拷贝苯酚稀释荧光光谱图：（稀释后猝灭消失，且505nm处开始有峰）3.纸张的荧光光谱图

5.苯酚3D荧光扫描：

六、数据分析：

对于激发和发射荧光光谱的测定，可以得到的信息包括：激发光谱有倍频现象，即在336nm 和670nm处出现类似的峰，可以看出在670nm出峰的宽度变大，所以倍频峰不适合做定量定性检测。经过预扫描后，发现基本只需要从250nm扫描到750nm即可。记录的数据中最

大发射光的波长在259nm左右，最大激发光的波长在336nm，从而确定同步荧光光谱波长差为336-259=77nm，与理论（原理中给定的86nm）较为接近。同时从同步荧光光谱图可以看出两者接近同步（同波同峰）。对于样品稀释后的荧光光谱图，理论上荧光测定稀溶液，（c<），浓度大而产生的猝灭由于稀释而降低，从而实验样液稀释后应该会出现荧光强度大大增加的现象，再度稀释后可能会继续增加或者出现下降，再稀释基本为水的荧光图谱。（如图中苯酚的标准图谱）可以看出稀释荧光图谱中的趋势与理论吻合，先出现极大的增加，然后下降（由于本实验中数据问题，出现了乱码，极大增加的曲线未画出）且随着稀释，逐渐出现了一个异样的突峰，这个应该是水不纯出现的有机质的荧光干扰峰（苯酚强的时候被掩盖，苯酚稀释过度则显现）。在测定纸张的荧光时，由于纸张中的漂白剂等物质荧光效应强，先必须改变进光量，减小为1%，可以看出此时纸张仍有较大较明显的峰。

七．讨论与思考

1．对待测溶液进行预扫描的有何作用？

预扫描找出带测样品的最适宜激发波长、发射波长、倍频区间，缩短扫描区间，等到扫描溶液时，容易观察和明确峰的位置和代表的意义，使实验数据更精确，扫描时间更短，观察有无瑞利散射峰干扰。

2. 观察激发光波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？

激发波长的整数倍处荧光发射光谱会出现倍频峰。不适合于进行定量分析，因为在倍频峰出光谱的成分复杂，峰值较高，峰的宽度大，能帮助分析，但不适合定量分析，误差大。3．同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。

同步荧光选择性高、灵敏度强、干扰小，同步扫描有助于一些有机化合物的判别，特别是一些复杂的混合物。同步荧光法能简化光谱，减少光谱重叠和散射的影响。同步荧光法相对于激发光谱和发射光谱，峰较窄。在合适的扫描波长差值下，同时扫描激发光谱和发射光谱重叠波长处，才同时产生信号。

同步荧光光谱并不是荧光物质发射光谱与激发光谱的简单叠加。同步扫描至激发光谱与发射光谱重叠处才同时产生信号，所以要选择合适的扫描波长差值。在固定波长差同步扫描法中Δλ的选择直接影响到所得到的同步光谱的形状带宽和信号强度。通过控制Δλ提供了一种提高选择性的途径，提高了分析测试的选择性。

4．比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。

答：紫外分光光度是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的光谱分析法。

荧光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象。

和前者相比，荧光灵敏度高；发光参数多；分析线性范围比吸收光谱法宽；选择性更好；能分析的体系有限，应用范围不如前者。后者必须具有大的共轭π键结构。且只能分析极低浓度的物质。

参考文献：

《分析化学原理》---吴性良主编

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