毛细管电泳化学发光

毛细管电泳-化学发光联用

一、实验目的

1、学习毛细管电泳分离技术的基本原理

2、学习化学发光检测技术

3、学习场放大富集进样技术提高毛细管电泳分析法的灵敏度

二、实验原理

毛细管电泳(CE,capillaryelectrophoresis)，又称高效毛细管电泳(HPCE,highperformancecapillaryelectrophoresis)，或毛细管电泳分离法(CESM,capillaryelectro-separationmethod)，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性(电荷、大小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性)为根据的液相微分离分析技术。

毛细管和化学发光的联用，兼备了毛细管电泳的分离效率与化学发光灵敏度高及分析速度快，已得到了迅速发展。化学发光就是在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。化学发光法灵敏度极高；仪器设备简单；不需要光源、单色器和背景校正；发射光强度测量无干扰，无背景光、散射光等干扰；线性范围宽，分析速度快。

鲁米诺化学发光体系是研究最广泛的一类化学发光体系。鲁米诺在碱性介质中可以被多种氧化剂氧化生成激发产物，然后发光。这一反应可以被许多金属离子Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等催化，利用这一现象可间接检测这些金属离子。

在毛细管电泳中，常采用柱上样品富集技术提高检测灵敏度。当样品溶液的电导率小于载体电解质的电导率时，样品离子就可以得到富集，或称为场放大进样。

三、仪器和试剂

仪器：MPI-B型多参数化学分析测试系统；酸度计；电子天平；超声波清洗器；分离毛细管；反应毛细管；注射器。

试剂：2mmol/LLuminol溶液；10-5mol/LNi2+溶液；10mmol/LH2O2溶液；50mmol/LNaHCO3-NaOH溶液(pH12.0)；50mmol/LHAc-NaAc缓冲溶液（pH4.70）。

四、实验方法

1、实验前先排除气泡：先用超纯水冲管，再用电泳液冲管，至基线、电流平稳即可。

2、启动毛细管电泳高压和光电倍增管高压，依次进样用超纯水和运行缓冲溶液稀释得到相同浓度的Ni2+

溶液，进行检测。

3、以时间为横坐标，发光强度为纵坐标，绘制实验曲线。

五、实验结果

进样条件:室温:25℃;

柱后液流量:44μL/min;

柱后液:2mmol/LLuminol+10mmol/LH2O2+0.05mol/LNaHCO3-NaOH（pH12.0）;

电泳液:10mmol/LHIBA+50mmol/LHAc-NaAc缓冲溶液（pH4.70）;

进样:10s,10kV;

分离高压:15kV.

场放大效应

峰:a:1mL1.0×10-5mol/LNi2++1mL50mmol/LHAc-NaAc缓冲溶液;

b:1mL1.0×10-5mol/LNi2++0.2mL50mmol/LHAc-NaAc缓冲溶液+0.8mL超纯水;

c:1mL1.0×10-5mol/LNi2++1mL超纯水.

六、思考题

1、简述毛细管电泳的基本原理

答：毛细管作为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性（电荷、淌度等）为分离依据。在电解质溶液中，带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于毛细管电泳中使用了内径很小的毛细管，显着地降低了高电压所产生的焦耳热效应，因此可以在分析过程中应用更高的电压。高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，一般可以达到每米高达几十万理论塔板数，有时甚至可以达到数百万。

在高压电场作用下，毛细管内粒子发生电泳和电渗流两种形式的运动。带相反电荷的离子，其受到的电泳作用力的方向也相反。电渗流的方向始终是由毛细管电泳的正极流向负极。由于不同离子所带电荷及性质的不同，引起迁移速率不同，从而可以对不同离子进行分离。

2、毛细管电泳理想的检测器应具备哪些特征？

答：毛细管电泳理想的检测器应具备以下特征：（1）装置简单；（2）高灵敏度；（3）死体积小；（4）价格便宜；（5）应用面广；（6）不受电泳分离高压的影响。目前已发展了许多类型的检测器，有光学的、电学的及质谱检测器等。

3、简述鲁米诺化学发光体系的发光原理。

答：化学发光反应基本原理：在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B=C+D*

D*→D+Light

（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；

（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170～300kJ/mol；位于可见光区；

（3）发光持续时间较长，反应持续进行。

4、为什么场放大进样能提高检测灵敏度？

答：在毛细管电泳中，常采用柱上样品富集技术提高检测灵敏度。当样品溶液的电导率小于载体电解质的电导率时，样品离子就可以得到富集。