植物抗病基因研究进展

植物抗病基因研究进展

摘要:植物抗病基因的研究是目前植物病理学科的热点及难点之一。对植物抗病基因R基因的

克隆方法，成功克隆的基因、抗病基因产物的结构特征及植物抗病基因的进化进行了综述，

并对植物抗病基因工程的研究取得的成绩、存在的问题及展望进行了简介。

关键词:抗病基因; 克隆方法；结构特征; R基因进化

植物病害是农业生产的主要限制因子之一,人类克服植物病害的主要途径之一是利用抗性资源,通过常规育种的方法培育抗病品种。但由于植物抗病性的复杂性以及人们对植物与病原物互作机制认识的匮乏,再加上常规育种途径本身的局限性,抗病育种一直是农业生产上的重大难题。而在最近的几年里,人们克隆到了多个植物抗病基因,使得对寄主与病原相互作用分子机理的研究得到迅速的发展,为抗病基因在生产上的应用进行了有益的探索并展示了诱人的前景。

1抗病基因的克隆方法

1.1 表型基因克隆法: 利用表现型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。表型克隆在策略上试图将表型基因与结构基因表达的特征联系起来, 从而分离特定的与表型相关的基因, 力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位, 根据基因的表达效应就能直接分离该基因。

1.2 转座子标签技术: 转座子标签技术是比较经典的方法, 是将转座子或T- DNA 插入到欲分离基因的内部, 基因发生突变而被标识, 然后利用插入<=6 片段做探针克隆到抗病基因。

1.3 mRNA 差异显示法: 是由Peng Liang 等人在1992 年建立的筛选基因差异表达的有效方法。它是将mRNA 逆转录技术和PCR 技术相结合的一种RNA 指纹图谱技术。具体操作流程如下: 组织样品总RNA 的提取→去除RNA 样品中的微量DNA→设计引物序列→逆转录归类反应体系的建立→PCR选择性扩增→mRNA DD- PCR 产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳→差异表达条带的回收→回收条带的再次扩增→二次扩增产物的克隆、测序和Gen-Bank 查询→Northern Blot 和Dot Blot 杂交。

1.4 功能克隆: 即利用病害已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋白质氨基酸缺陷的信息进行基因定位, 进而克隆该致病基因。

1.5 同源序列克隆基因: 根据已知的抗病基因设计引物, 从相近物种中克隆其同源基因。

1.6 DNA 芯片技术: 一种大规模集成的固相杂交, 是指在固相支持物上原位合成(in situ synthe-sis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA 探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面, 然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析, 得出样品的遗传信息( 基因序列及表达的信息)。

1.7 图位克隆法: 针对寄主植物与病原菌互作的遗传模式( 即与亲和性因子相关的互作模式或与非亲和因子相关的互作模式) 创造R 基因近等基因系(near isogenic line, NIL) 及作图群体材料。由于常用的F2代作图群体不很稳定, 目前

发展了以双二倍群体DHL(double haploid population)、重组自交系RIL (recombinant inbred line) 以及回交世代为材料。之后用RAPD 和RFLP 等方法对R 基因进行定位, 找到与R 基因紧密连锁的分子标记, 并以此作为起始探针, 借助“染色体步行(chromosome walk-ing)”或“染色体登陆(chromosome landing)”, 在含目的R 基因的植物基因组YAC 或BAC 文库中筛选分离出目的基因, 并通过转化互补试验进行验证。

1.8 生物信息学的方法用于新基因的发现和鉴定。表达序列标签EST(expressed sequence tags)是基因表达的短cDNA 序列, 它们携带完整基因某些片段的信息。大多数情况下, EST 克隆并不跨越基因的全长区, 但有许多生物信息学工具可以帮助获取某一基因的全长转录体信息及其在染色体作图中的精确定位。近几年EST 数据库的快速增长, 增加了从EST 出发寻找新基因的可能, 特别是从试验测得的与功能联系的新EST 发现新基因的可能性更大, 通过对已知功能的抗性基因EST 序列片段的拼接, 以及EST 序列和基因组序列的比对, 可以寻找新的全长抗性基因[1]。

2抗病基因产物结构特征

从已克隆的植物抗性基因来看，除Hml,Mlo不符和基因对基因的假说外，其他抗性基因均表现出特征的保守结构域。如亮氨酸拉链（LZ），核苷酸结合位点（NBS)，富含亮氨酸重复（LRR），以及与果蝇Toll蛋白及哺乳动物白细胞介素—1受体的胞外相似区域（TIR），丝—苏氨酸蛋白激酶结构域等[2-3]。

2.1亮氨酸拉链（LZ）

LZ存在于一些寡聚蛋白质中，许多DNA结合蛋白就含有LZ。在真核生物转录因子的同源及异源二聚体形成中起重要作用，相似的卷曲螺旋结构域促进了蛋白质间的相互作用并导致许多其他功能的产生。抗性基因中存在的LZ可能在抗病反应信号传导过程中与病原物产生的配体结构特异性结合有关[4]。

2.2丝氨酸—苏氨酸蛋白质激酶域

含有丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶结构域是抗病基因产物的一个特征，该激酶在抗病反映信号传导中通过磷酸化其他信号分子而传导信息。Pto基因的氨基酸序列分析表明，它含有这些保守的区域，Pto在离体条件下具有蛋白激酶的催化活性[5]。

2.3富含亮氨酸重复的受体结构域(LRR)

LRR因亮氨酸在这一结构中呈规律性重复而得名，存在于多种功能不同的蛋白中，与蛋白质之间的相互作用及信号传导有密切关系。它也可含有较规律分配的脯氨酸和天冬氨酸，从而决定着含LRR蛋白的晶体结构。LRR构成马蹄形结构或环状的三级结构。在功能方面这种富含亮氨酸的结构域决定着与配体（无毒基因的产物）结合的专一性，即决定着寄主与病原的特异性识别。如cf-2, cf-4, cf-5, cf-9,Xa21都有这种结构域。

2.4 NBS核苷酸结合位点

许多抗病基因除编码LRR外也编码同已知的核苷酸结合位点极其相似的氨