生物技术与食品产业

三、限制性内切酶的切割位点
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序 列具有回文结构特征，切断的双链DNA都 产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核 酸内切酶识别和切割的特异性不同
EcoR 1 from E.coli
G AAT T C C T TAA G AA G C T T T T C G AA
PALINDROME
分子生物学是基因工程的基础。
工具酶
• 三大类：
– 限制性内切酶 – 连接酶 – 修饰酶
Restriction enzymes( recognize specific short sequences of DNA and cleave the duplex (sometimes at target site, sometimes elsewhere, depending on type). 识别序列常是一组含4-6个核苷酸的回文序列. 是一类能识别和切割双链DNA分子中的某特定核苷核 酸序列的酶 Restriction map is a linear array of sites on DNA cleaved by various restriction enzymes. DNA限制酶切片段沿染色体或染色体片段的依次排列 称作限制图谱.
• DNA变性、复性与杂交
– DNA变性（DNA denaturation）：在高温及强碱 长期保持下，双链DNA分子氢键断裂，两条链完 全分离，形成单DNA分子。 – 复性（renaturation）或退火(annealing)：变性 DNA分子经处理又可重新形成天然DNA分子，这 个过程称～。降低温度、pH及增加盐浓度均可促 进DNA的复性。 – 杂交（hybridization）:当复性DNA分子由不同的 两条链分子形成时，这种复性称为～。
DNA自我复制示意图
DNA双螺旋碱基配对图
RNA（核糖核酸）
• 存在于细胞质中
• 分别有三种功能不同的RNA rRNA tRNA rRNA • mRNA为遗传密码，由DNA转录而来
• 基因是含有一定功能的DNA片段，是遗传的基本单位。 • 获取某段有一定生理功能的DNA片段叫基因克隆。
有关基因的概念
载 体 基 因 片 段
基因工程的一般操作步骤
目的基因的获得 载体的选择
重组质粒的构建 导入目标生物体细胞内 转基因重组体的获得 转基因生物的鉴定
基 因 工 程 的 特 点
• 生物的基因可以在人类、动物、植物和微 生物四大系统间进行交流
• 可以大大缩短育种年限。
• 变异可以定向
基因工程的基本原理和内容
Restriction Nucleases
• 不同有限制性核酸内切酶识别的DNA序列可以不相同。有 的识别四核苷酸序列，有的识别六或八核苷酸序列。 • 如果DNA中的核苷酸序列是随机排列的，则一个识别四核 苷酸序列的内切酶平均每隔256bp（44）出现一次该酶的 识别切割位点，同样的对识别六或八核苷酸序列的内切酶 则大致上分别是每隔4096bp(46)或65,536bp(48)出现一 次识别切割位点。按此可大致估计一个未知的DNA分子限 制性内切酶可能具有切点频率，以便选用合适的内切酶。
• 限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近800多种， 可以根据它们对DNA有不同的识别序列和切割特征选用， 从而为基因工程提供了有力的工具。表列出了几种最常用 的限制性核酸内切酶的识别序列和切割点。
几种最常用的限制性核酸内切酶 识别序列和切割点
限制性核酸内切酶名称
BamHⅠ Cla Ⅰ EcoR Ⅰ Hind Ⅲ HindⅡ KpnⅠ Not Ⅰ Pst Ⅰ Sal Ⅰ Sau3A Ⅰ Sfi Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ
• 重叠基因（overlapping gene）：是指 一个基因的序列中，含有另一个基因的 部分或全部序列，即其核苷酸序列是重 叠的。基因重叠现象仅发现于一些噬菌 和病毒基因组中。
中心法则
转录 翻译
DNA
反转录
RNA
蛋白质
基 因 重 组
• 目的基因与载体基因，标记基因等的连接 叫基因重组 • 重组质粒基因包括： 标记片段 启动子 目的基因 终止子
• 基因工程的内容和方法 • 主要内容：
– 分离制取带有目的基因的DNA片段；在体 外，将目的基因连接到行当的载体上；将重 组的DNA分子导入受体细胞并扩增繁殖； 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重 组DNA分子的重组体；外源基因的表达和 产物的分离和纯化。
• 主要方法
– 密度梯度离心；DNA分子的切割与连接、 核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、 DNA序列结构分析以及人工合成、基因定 点突变和PCR扩增等多种新技术、新方法。
II Mg++ ATP 特异
III 双链DNA
识别序列
特异(识别和结合于特定 特异 的DNA序列位点)
识文序列
否
在识别序列周围 25-30bp范围内固 定位点 有
随机切断在识别位点以 识别位点范围内或 外的DNA序列，通常在识 它近端处固定位点 别位点周围400-1000bp 有 无
• DNA修复主要包括三个步骤：
• 基因
– 基因是具有遗传疚的DNA片段，也是编码 蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单 位。 – 2001.2.12由美、中、日、英、法等国宣布 人类基因组草图完成，人类基因组由31.67 亿个碱基组成，共有3万个左右基因 – 现代研究表明：基因是一个功能单位，但不 是一个不可分割的的最小的重组单位和突变 单位，它包含若干个空谈子和重组子。
• 假基因（pseudo gene）在真核生物中 普遍存在。这是一类在基因中稳定存在， 核苷酸序列同其相应的正常功能基因基 本相同、但却不能合成出有功能的蛋白 质的失活基因，它是相应的正常基因空 谈而丧失活性的结果。人类基因中与蛋 白质合成有关的基因只占整个人类基因 组的2%。
• 重复序列（repeated sequence）：是 指在一个DNA分子中出现不止一次的序 列。 几乎所有的真核生物的基因组DNA 中都有重复序列。在人类基因组计划中 发现，35.3%的基因组包含重复序列。
人类染色体组示意图
细胞核示意图
动物细胞示意图
植物细胞示意图
DNA（脱氧核糖核酸）
1. 由两条极性相反并互补的多聚核苷酸链围绕 中心轴的双螺旋结构。 2. 两条链中的碱基之间按照A配T,G配C的互补 原则，以氢键连接。 其中A为：腺嘌呤 T为：胸腺嘧啶 G为：鸟嘌呤 C为：胞嘧啶 U为：尿嘧啶 (RNA) 3. DNA 直线排列于染色体上，存在于细胞核 中。 4. DNA有自我复制的能力。
BamHⅠ Cla I EcoR Ⅰ Hind III
限制性核酸内切酶的分类
限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease）
识别DNA的特异序列，并在识别位 点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 是细菌内存在的保护性酶。分为I、 II、III三类。
I DNA底物 辅因子 双链DNA Mg++ ATP SAM 双链DNA Mg++
palindrome
Hind III from Haemophilus influenza
限制性核酸内切酶作用后产生两种末端： 钝性末端(blunt end/flush end) 粘性末端(sticky end/cohesive end )
Hind III
GTCGAC CAGCTG
BamH I
GGATCC CCTAGG
• 移动基因（movable gene）：是指一个或以 从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位 置，甚至在不同的染色体之间跃迁，故也称为 跳跃基因。但这种移动只是移动一个拷贝，在 原来的位置还保留一份拷贝。 • 断裂基因（split gene; interrupted gene）： 基因编码序列中有与氨基酸编码无关的DNA 间隔序列，使一个基因分隔成不连续的若干区 段。这种编码序列不连续的间断基因称为～。
• DNA的修复
– DNA复制时可能由于DNA聚合酶引发的偶 然的错误，或者由于环境因素致使DNA产 生序列上的错误，此时生物体内存在着的修 复系统就会对DNA的变异起保护修复的作 用。 – DNA修复核酸酶对DNA双链上不正常的碱 基的识别与切割；DNA聚合酶对已切割区 域的重新合成；DNA连接酶对剩下切口的 修补
第二章 基因工程与食品科学
• 概述 • 基因工程定义
– 是指按人们的需要，用类似工程设计的方法将不同 来源的基因（DNA分子），在体外构建杂种DNA 分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、 转录和表达的操作。又称为DNA重组技术。
• 基因工程的实施包括四个必要的条件：工具酶、 基因、载体和受体
一、基本概念
1. 2. 3. 4. 5. 染色体 DNA（脱氧核糖核酸） RNA（核糖核酸） 基因 中心法则
• 1、DNA分子是由两条互 相平行的脱氧核苷酸长链 盘绕而成的。 2、DNA分子中的脱氧核 糖和磷酸交替连接，排在 外侧，构成基本骨架，碱 基排列在内侧。 3、两条链上的碱基通过 氢键相结合，形成碱基对， 它的组成有一定的规律。
限制性核酸内切酶的命名
• 按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母大 写与种名的头两个字母小写组成的三个斜体字母作略 语表示； • 如有株名，再加上一个字母； • 其后用大写罗马数码Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……区分同菌株种内 具有的不同限制性修饰系统 。 例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名 为HindⅠ、HindⅡ和HindIII。
• 找出某段有一定生理功能的DNA片段在染色体上的位 置叫基因定位。
• 测定出某段有一定生理功能的DNA片段的碱基序列叫 基因测序。 • 按照一定的碱基序列，以核苷酸为原料，合成某段有 一定生理功能的DNA片段叫基因合成。
基因工程研究的对象
研究生物大分子，如：蛋白质、 核酸、多糖等调节生命过程的物质，包 括它们的结构、性状、代谢。
• 基因工程的分子生物学基础
– – – – – – – 脱氧核糖核酸 DNA变性、复性和杂交 DNA的复制 DNA的修复 生物的基因重组 基因 遗传信息的传递方向
• 脱氧核糖核酸
– 生物的遗传物质是DNA。DNA是由大量的 脱氧核糖核苷酸组成的线状或环状生物大分 子。由碱基、磷酸、戊糖组成。碱基由腺嘌 噙（A）、鸟嘌噙（G）、胞嘧啶（C）与胸 腺嘧啶（T）组成。
• DNA的复制 • 复制是一个复杂的过程，可参看有关书籍。
– DNA复制特点：从特定的开始并按特定的方向进 行（5’→3’）；DNA分子的复性是半保留复制； DNA分子的复制是半不连续复制；DNA分子的复 制是通过DNA聚合酶及各种相关的酶蛋白、蛋白 因子的协同有序的工作完成的；DNA分子复制具 有高度的精确性和准确性 – DNA分子复制的速度：细菌：104~105核苷酸/min， 而在真核细胞中为500~5000核苷酸/min
GTC GAC + CAG CTG
G + GATCC G CCTAG
粘性末端
5' AATTC 5´-端突出 3' G
3´-端突出
5' G 3' ACGTC
限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。
不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端
（compatible end），可用连接酶连接。
A
B
C
Restriction Nucleases
• 断裂基因的表达程序是：先转录成初级转录物， 又叫前体mRNA，然后经过删除和连接，除去 无关的DNA间隔序列的转录物，便形成了成 熟的mRNA分子；它从细胞核中输送到细胞质， 再译成相应有多肽链。其中被剪除的DNA部 分叫间隔序列或内含子（intron），被保留下 来的DNA部分叫编码序列或外显子（exon）。 这种内含子的除和外显子的连接，形成成熟的 mRNA的过程，称为RNA剪接。
甲基化功能
(ATP：腺嘌呤核苷三磷酸;SAM：S—腺苷酰甲硫氨酸)
是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性 核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。 II类酶识别序列特点为回文结构。 ·· · GGATCC ···· · ·· ·· ·· · CCTAGG ···· · ·· ··