化学发光法原理及应用

化学发光
2、酶促化学发光免疫分析
酶促化学发光免疫分析（chemiluminescentenzymeimmunoassay，CLELA）是以酶标 记抗原或抗体进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作 用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定，酶的浓度决定了化学发光的强度。辣根过 氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)为化学发光酶免疫分析常用的标记酶，发光底物以 鲁米诺、AMPPD（1，2-二氧环乙烷衍生物，一种碱性磷酸酶底物）为代表。
发光反应室
光检测器
信号放大器
显示与记录
目录
CONTENTS
1
化学发光原理
2 化学发光在免疫分析上的应用
3
化学发光-分子印迹技术
4
优缺点分析
化学发光
化学发光免疫分析
1977年，Halman等将化学发光与抗原抗体免疫反应相结合，创建了化学发光免疫分析 方法（chemiluminescent immunoassay，CLIA），相较于传统免疫技术（放射免疫技术、 酶免疫技术、荧光免疫技术等），CLIA具有自动化程度高、特异性好、精确度高、检测 范围广等优势。
化学发光 化学发光免疫分析的分类
根据标记物的不同 ➢ 直接化学发光免疫分析
CLIA可分为三大类： ➢ 酶促化学发光免疫分析
➢ 电化学发光免疫分析
化学发光
1、直接化学发光免疫分析
化学发光剂直接标记抗体或抗原的免疫测定方法称为化学发光免疫分析。
直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需要酶的催化作用，直接参与发 光反应，他们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗 体，目前常见的直接化学发光标记物主要有吖啶酯类化学发光剂。
化学发光仪 （仪器价格便宜）
目录
CONTENTS
1
化学发光原理
2
化学发光在免疫分析上的应用
3 化学发光-分子印迹技术
4
优缺点分析
化学发光 化学发光-分子印迹技术
化学发光检测法的选择性尚达不到直接测定实际样品的需要。 分子印迹（MIT）是一种具有高度识别性和选择 性的新技术。利用分子印迹聚合物（MIPs）模 拟酶-底物或抗体-抗原之间的相互作用，对印迹 分子（也称模板分子）进行专一识别的技术。通 俗地讲, 即定制具有特异性识别“钥匙(模板)”的 能力的“人锁”的技术 。由于该技术预定性、 识别性和实用性的特点，使其在许多领域（如色 谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临 床药物分析等方面）得到广泛应用。
化学发光
鲁米诺+HRP发光体系
该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体，在与反应 体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被 抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺 发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。
化学发光
ALP+AMPPD发光体系
碱性磷酸酶（ALP）和1，2-二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发 光体系，其中最具代表性的是ALP-AMPPD发光体系。该反应体系以碱性磷酸酶标记抗 体，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测 抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基 团而发光。
化学发光
基于双电极性质的磁珠电化学发光免疫分析新方法研究
商品化的流通型磁珠电化学发光免疫分析方法存在工作电极再生难，化学清洗难于完全恢复等 问题，使工作电极表面性质因多次测定后性质差异大而导致分析结果误差大。Yang等人建立了一种 基于双电极性质的磁珠电化学发光免疫检测新方法。钌联吡啶-TPA电化学发光体系在碳电极和金电 极上具有不同的电化学发光行为，基此， Yang等人以化学沉积法制得了金纳米阵列电极（NEEs） 聚碳酸酯膜为工作电极，在磁场作用下将Anti-CA-199（biotin）固定于磁珠富集于工作电极表面， 结合检测目标物癌标志物CA-199后，再结合钌联吡啶衍生物标记的Anti-CA-199抗体，进行电化学 发光检测，建立了快速检测胃癌标志物的电化学发光分析新方法。实验结果表明：电化学发光信号 值与CA-199的浓度在0.5U/mL - 20U/mL范围内呈良好的线性关系。
化学发光法原理及应用
汇报人：88 日期：2020年11月11日
目录
CONTENTS
1
化学发光原理
2
化学发光在免疫分析上的应用
3
化学发光-分子印迹法
4
优缺点分析
化学发光 原理
化学发光是一种伴随化学反应的光发射的现象。
某些物质（发光剂）在进行化学反应过程 中，由于吸收了反应产生的化学能而被激发， 从激发态返回基态时，发射出一定波长的光， 这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发 光(chemiluminescence) 。
化学发光
和酶联免疫分析进行对比
不同点
酶联免疫分析
化学发光免疫分析
原理 以酶标记抗体或抗原，对酶有特定要求，活性高，纯度高 用发光剂标记抗原或抗体
标记物 仪器
酶（辣根过氧Leabharlann 物酶或碱性磷酸酶）通过加酶的底物显色，用酶标检测仪比色来进行检测 （仪器价格昂贵，但使用更为广泛）
化学发光物质（鲁米诺及 其衍生物等）
• 必须存在形成电子激发态的通道。 • 激发态分子必须以辐射光子的形式回到基态, 或将能量
传递给荧光分子。
化学发光 化学发光反应及装置流程
直接化学发光 A + B C* + D
C* C + h1
间接化学反应发光 A + B C* + D C* + F F* + C
F* F + h2
装置流程：
化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋 发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。
化学发光 1、 化学发光对应的能级跃迁
荧光产生的原理
入射光(h1)激发下的光发射现象
入射光
h1
荧光
h2
磷光
h3
化学发光的原理
化学反应释放的能量(-G)使基态物质被
激发而产生的后续光发射现象
化学发光包含化学反应、能量传递以及后 续激发态弛豫(与荧光一致)三个过程
化学发光
3、电化学发光免疫分析
在电极上施加一定的电压或电流时，在电极电化学反应产物之间或电极反应产物与 溶液中某种组分之间发生化学反应而产生激发态，当激发态跃迁回基态时放出能量， 此过程即为电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)。
电化学发光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)是以电化学发光 剂三联吡啶钌标记抗体，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特 异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。
缺点： 1. 选择性差，会对一个系列的化合物做出反应，而不是针对单个的某一化合物。 2. 化学发光的发射强度依赖于各种环境因素，在不同的环境体系中，发射强度和
时间的曲线有较大的差别，所以必须严格控制外界的各种因素。
THANKS !
化学发光
1、直接化学发光免疫分析
用吖啶酯直接标记抗体，与待测标本中相应的 抗原发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗 原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂 （H202）和NaOH行成碱性环境，吖啶酯即可在不 需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光 电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能， 这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标 准曲线上计算出待测抗原的含量。
CLIA
化学发光分析系统
化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的 氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的 基态时，同时发射出光子（hν）利用发光信号测量仪器测量光量子 产额。
免疫反应系统
免疫反应系统是将发光物质（在反应剂激发下生成激发态中间体） 直接标记在抗原或抗体上，或酶作用于发光底物。化学检测系统通 过光电信号检测仪检测发光强度，最后通过化学发光标记物与发光 强度的关系确定被测物的含量。
目录
CONTENTS
1
化学发光原理
2
化学发光在免疫分析上的应用
3
化学发光-分子印迹技术
4
优缺点分析
化学发光
优缺点对比
优点： 1. 不需要外部光源：
• 消除了入射光的干扰（瑞利散射和拉曼散射） • 克服了光源不稳定而导致的波动的缺点，降低了噪声，提高了信噪比。 2. 灵敏度高（可达ng级或pg级） 3. 线性范围宽（可达三个数量级） 4. 设备简单、分析速度快、易实现自动化
化学 反应
-G
化学发
光h
化学发光
化学发光反应发生的条件
能量，通道，荧光物质
• 化学反应是放热反应。
化学反应的自由能的变化与发光波长的关系: –G h / ex 2.857 × 10 – 4 千卡 / ex 摩尔
400~750nm的可见光发射时所需要的G 的数值应在 38~71千卡(170～300 kJ/mol)之间。